Saonari†Alamat saonari: OX11 0DE, Inggris, Gedung Berlian, Taman Ilmu Pengetahuan dan Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Pusat Pencitraan Biologis Elektronik Berlian Sumber Cahaya Co.
Pusat reaksi kompleks panen cahaya 1 (RC-LH1) ima komponen fotosintesis inti bakteri fototrofik ungu. Dipaboa hami ma dua struktur mikroskopi krio-elektron kompleks RC-LH1 sian bulung-bulung na marbulung-bulung. Struktur resolusi 2,65-Å kompleks RC-LH114-W tardiri tingon 14 subunit loop LH1 na manghaliangi RC, na targanggu ni protein W, sadangkan kompleks na so adong protein-W ima komposisi RC na lengkap na ihaliangi RC. Ditutup 16 subsatuan LH1 lingkaran. Perbandingan struktur on mangalehen wawasan tu dinamika kinon i kompleks RC-LH1, tarmasuk parubahan konformasi na inda itontuon i jolo tingon mangikat kinon i situs QB RC, songoni juo inganan situs mangikat kinon bantu, na mangurupi Pass alai tu RC. Struktur unik ni protein W mangambati panutupan ni lingkaran LH1, marhite i mambahen saluran laho mamparcepat partukaran kinon/kinolon.
Energi na iparade tingon fotosintesis bisa mampartahankon ampir sude kehidupan i bumi, dot puna potensi na godang tu bioteknologi surya. Dohot mandorong fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu juo patuduhon marragam mode energi dot kemampuan metabolisme. Boi do nasida pasidingkon fotosintesis jala tubu gabe bakteri heterotrofik di inganan na holom, boi paturehon nitrogen dohot karbondioksida, mambahen hidrogen, jala manegai senyawa aromatik (1-3). Asa boi mangalehon energi tu proses-proses on, ingkon hatop jala denggan do panondang i diuba gabe energi kimia. Proses on dimulai molo kompleks antena na manjebak cahaya menyerap cahaya jala papindahon energi na tarjebak tu pusat reaksi (RC), marhite i mamungka pemisahan muatan (4 – 7). Unit dasar fotosintesis i bakteri fototrofik ungu tardiri tingon RC tipe 2, na ihaliangi kompleks panen cahaya 1 (LH1), mambaen kompleks inti RC-LH1. LH1 dibentuk sian rangkaian heterodimer αβ na melengkung, na ganup mangikat dua molekul klorofil bakteri (BChl) sada manang dua karotenoid (8-12). Antena LH1 na paling sederhana terdiri sian 16 manang 17 heterodimer αβ na manghaliangi RC (9-13) di bagasan lingkaran na tartutup, alai di kompleks inti na asing, peptida transmembran mangganggu kesinambungan ni LH1 na manghaliangi , Marhite i mambahen difusi kinol/kinon dohot kompleks bRC1, 13-15). Tumbuhan fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) ima organisme model na bisa mangantusi energi dot transfer elektron na mandukung fotosintesis. Struktur kristal na parjolo sian Rps. Model ni kompleks RC-LH1 palustris ima RC, dihaliangi 15 lingkaran LH1 heterodimer, na diponggolhon sada protein na so binoto na margoar “Protein W” (14). 10,5 kDa na so marciri dohot tolu heliks transmembran (TMH) na diprediksi (16). Diusulhon hami do asa diganti goar ni gen rpa4402 na mangkode protein W gabe pufW asa sadalan dohot goar na dipangke tu gen na mangkode subunit RC-L, M (pufL, pufM) dohot LH1α, β (pufA, pufB). Na menarik, protein-W holan adong di hira-hira 10% sian RC-LH1, na mangungkaphon Rps. palustris manghasilhon dua kompleks RC-LH1 na marasing. Dison, hami melaporkan struktur krio-EM (krio-EM) resolusi tinggi sian dua kompleks inti, sada na marprotein W dohot 14 heterodimer αβ, na sada nari so marprotein W dohot lingkaran LH1 16 heterodimer na tertutup. Struktur nami mewakili perubahan langkah di pangantusion kompleks RC-LH1 ni Rps. palustris, ala nunga dianalisis hami populasi na sarupa sian ganup varian jala adong resolusi na tuk laho tangkas manuntuhon ganup peptida dohot pigmen na terikat dohot lipid dohot kinon na mardomu tusi. Perbandingan struktur on patuduhon molo tolu protein TMH-W na so jumpang di kompleks RC-LH1 na asing saleleng on manghasilhon saluran kinon laho mamparcepat pertukaran kinon/kinonlon. Piga-piga inganan pangikat lipid dohot kinon na dilestarihon nunga ditanda, jala nunga hupaboa hami parubahan konformasi na imbaru dung dipadomu kinon dohot RC, na boi cocok tu RC fotosistem II (PSII) ni organisme fototrofik na maroksigen. Hatorangan nami mangalehon wawasan na imbaru taringot tu kinetika pengikatan dohot pertukaran kinon / kinol di kompleks inti RC-LH1 ni bakteri fototrofik ungu.
Asa mura diulahon studi na rinci taringot tu dua kompleks na dapot di Rps. RC-LH1, diisolasi hami ma ganup marhite cara biokimia. Kompleks na hurang protein W (na digoari ΔpufW) dimurnihon sian galur na hurang gen pufW (16), jala holan sada kompleks RC-LH1 do na boi dihasilhon. Kompleks na marisi protein W dihasilhon sian sada galur. Protein W tingon galur on imodifikasi dohot tanda His 10x i ujung C-na, anso kompleks na marisi protein W bisa efektif igabung dohot protein W na paling hurang dohot mambaen logam inda margerak. Kompleks na efektif dipisahkan (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Songon na dipatuduhon di Gambar 1, duansa kompleks i marisi tolu sub-unit RC (RC-L, RC-M dohot RC-H) na dihaliangi antena LH1. Struktur 2,80-A ni kompleks na hurang protein-W patuduhon 16 heterodimer αβ, mambahen lingkaran LH1 na tartutup na lengkap manghaliangi RC, dung on digoari kompleks RC-LH116. Struktur 2,65 Å kompleks na marisi protein-W puna LH1 heterodimer 14 na iganggu protein-W, saonnari idokon manjadi RC-LH114-W.
(A dohot B) Perwakilan permukaan ni senyawa. (C dohot D) Pigmen na mardomu na dipatuduhon di bagasan batang. (E dohot F) Kompleks na diida sian parmukaan sitoplasma adong do peptida dohot subunit LH1 na diwakili di kartun, jala dibahen nomor searah jarum jam sian celah protein-W [sadalan dohot penomoran Rba. kompleks ni bulung-bulung (13)]. Molo LH1-α, warna ni protein na marwarna kuning; molo LH1-β, warna ni protein na birong; molo protin-W, marwarna merah do protin i; molo RC-H, marwarna sian do i; molo RC-L, ima Oranye; untuk RC-M, warna merah jambu. Kofaktor igambarkan dohot batang, warna hijau manggombarkon molekul BChl dot BPh a, warna ungu manggombarkon karotenoid, dot warna kuning manggombarkon molekul UQ10. (G dohot H) Pamerengan na diperbesar sian celah protein-W di daerah setara kompleks RC-LH114-W (G) dohot kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor dipatuduhon marrumang pengisian ruang, kinon kelat dipatuduhon marwarna biru. Celah protein-W disorot dohot garis putus-putus na birong di (G), jala lubang-lubang na metmet inganan ni kinon/kinolol marsebar di cincin LH116 disorot dohot garis putus-putus na hitam di (H).
(A dohot B) patuduhon RC na dihaliangi susunan na tarbuka manang na tartutup sian heterodimer LH1αβ, na ganup mangikat dua BChl dohot sada karotenoid (Gambar 1, C dohot D). Studi na salpu nunga patuduhon Rps ima kompleks LH1. I jalur biosintesis xantin spirulina, spesies on mengandung populasi campuran karotenoid (17). Alai, spiropiroksantin do karotenoid na dominan jala kepadatanna memuaskan. Alani i, dipillit hami ma model spiroksantin di sude inganan pengikat LH1. Polipeptida alfa dohot beta ima TMH tunggal dohot daerah luar selaput pendek (Gambar 1, A, B, E, dan F). Nang pe ndang diida kepadatan 17 residu di ujung C, polipeptida alfa dibelah sian Met1 tu Ala46 di dua kompleks i. β polipeptida dikurangi sian Gly4 gabe Tyr52 di RC-LH116, jala sian Ser5 gabe Tyr52 di RC-LH114-W. Ndang adong diida kepadatan 3 manang 4 sisa ujung N manang 13 ujung C (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks RC-LH1 campuran na diparade sian galur tipe liar patuduhon, daerah na hurang i ma hasil ni pembelahan heterolog ni peptida on (Gambar S1 dohot S2). Formilasi ujung N ni α-Met1 pe diida do (f). Analisis i patuduhon, peptida α terdiri sian residu fMet1 sahat tu Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, jala β-peptida terdiri sian residu Ser2 sahat tu Ala53, na denggan do hombar tu peta kepadatan EM suhu rendah.
Koordinasi α-Nya29 dohot β-Nya36 mambahen BChls adop bohi; ganup heterodimer αβ marpungu dohot hombar jabuna laho mambahen lingkaran na tarbuka (RC-LH114-W) manang lingkaran na tartutup (RC-LH116) di humaliang ni RC Rangkaian pigmen na margabung eksiton (Gambar 1, C dohot D). Dibandingkon dohot pita 877 nm ni RC-LH114-W, pergeseran merah penyerapan 880 nm ni RC-LH116 ima 3 nm (Gambar 2A). Alai, spektrum dikroisme melingkar hampir sarupa (Gambar 2B), na patuduhon nang pe adong perbedaan na jelas antara loop terbuka dohot tertutup, lingkungan lokal ni BChls mansai sarupa. Pergeseran merah penyerapan boi do hasil ni gerak termal na moru dohot stabilitas na lam tamba di lingkaran na tartutup (18, 19), perubahan kopling pigmen na dibahen lingkaran na tartutup (20, 21), manang kombinasi ni dua efek on (11).
(A) Spektrum penyerapan ultra-ungu/tarida/jonok-inframerah, puncakna ditanda dohot pigmen na hombar tusi jala dinormalisasi tu puncak BPh di 775 nm. (B) Spektrum dikroisme melingkar dinormalisasi tu penyerapan BChl di 805 nm. (C dohot D) Spektrum ΔA na dipillit sian spektrum penyerapan na diselesaikan waktu kompleks RC-LH114-W (C) dohot kompleks RC-LH116 (D). Asa lam denggan parbandingan, sude spektrum dinormalisasi tu ∆A sian −A di 0,2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 dung iradiasi di hadirion ni berbagai konsentrasi UQ2 (ida Gambar S8 untuk data mentah). (F) Di sel na tubu di toru ni panondang na marsinondang na rendah, menengah manang na timbo (10, 30 manang 300 μM-2 s-1), subunit protein W dohot RC-L di kompleks na dimurnihon dohot rasio membran na dipisah. Tontuhon ma tingkat protein marhite elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dohot imunoassay (ida Gambar S9 untuk data mentah). Tontuhon ma rasio relatif tu kompleks RC-LH114-W na dimurnihon. Rasio stoikiometri RC-L tu protein-W kompleks ima 1:1.
1, A, C, dohot E) jonok tu donor utama RC (P) 6,8 Å sian BChl na setara di RC-LH116 (Gambar 1, B, D, D); alai, kinetika penyerapan sementara ni dua kompleks i patuduhon molo tu RC-LH114-W dohot RC-L116, konstanta waktu perpindahan energi eksitasi sian LH1 tu RC ima 40 ± 4 dohot 44 ± 3 ps (Gambar 2). , C dohot D, Gambar S4 dohot Tabel S2). Ndang adong muse perbedaan na signifikan di pemindahan elektronik di bagasan RC (Gambar S5 dohot teks tambahan na mardomu tusi). Hucurigai hami do, pardomuan na jonok ni tingki parpindahan ni energi antara LH1 dohot RC-P ala ni sarupa ni jarak, sudut dohot energi potensial ni godangan BChl di dua lingkaran LH1. Hira na mangalului pola energi LH1 asa sahat tu jarak minimum ndang hatop sian perpindahan energi langsung sian situs suboptimal tu RC. Loop LH1 lingkaran terbuka di RC-LH114-W pe boi do mangalami gerak termal na so pola ringkot di kondisi suhu na rendah laho analisis struktural, jala adong do konformasi cincin αβ14 na lobi ganjang di suhu kamar sian jarak pigmentasi βBChls di posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 mengandung 32 BChl dohot 16 karotenoid, jala susunan keseluruhan na sarupa do dohot na dapot sian pidpidum Thermochromatium (Tch. (12) dohot ganggang hijau (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Dung dibahen sejajar, holan penyimpangan na metmet do na diida di posisi ni heterodimer αβ, tarlumobi 1-5, 15, dohot 16 (Gambar S6). Hadirion ni protein-W marpanghorhon na balga tu struktur LH1. Tolu TMH na ihubungkon dohot lingkaran na jempek, dohot ujung N i sisi lumen kompleks dot ujung C i sisi sitoplasma (Gambar 1A dot 3, A sampe D). Protein-W bahatan hidrofobik (Gambar 3B), dot TMH2 dot TMH3 marinteraksi dohot LH1αβ-14 mambaen parmukaan transmembran (Gambar 3, B dot E sampe G). Antarmuka tarlobi tardiri tingon residu Phe, Leu dot Val i wilayah transmembran. Sisa-sisa on isusun dohot asam amino hidrofobik dot pigmen αβ-14. Piga-piga residu kutub juo mambaen interaksi, tarmasuk ikatan hidrogen antara W-Thr68 dot β-Trp42 i parmukaan rongga kompleks (Gambar 3, F dot G). Di parmukaan ni sitoplasma, Gln34 mardomu tu kelompok keto ni karotenoid αβ-14. Salain i, molekul n-dodesil β-d-maltoside (β-DDM) iselesaikan, dot ikur hidrofobikna marpanjang tu antarmuka antara protein-W dot αβ-14, dot ikur lipid bisa maringanan i pamatang. Diparrohahon hami do muse, mansai jonok do daerah resolusi ujung C ni protein W dohot RCH, alai ndang masuk tu lingkup membentuk interaksi na khusus (Gambar 1, A dohot E). Alai, boi do adong interaksi di asam amino C-ujung na so tarselesaikan sian dua protein on, na boi mangalehon mekanisme tu rekrutmen protein-W tingki papunguhon kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, na mangadopi antarmuka dohot LH1αβ14 di bagasan bentuk kartun, adong rante samping na marrumang batang (merah), na dipatuduhon di sada bagian diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu na tembus dohot tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W na diwakili marhite permukaan na marwarna hidrofobik. Daerah kutub dohot na marmuatan dipatuduhon marwarna cyan, daerah hidrofobik dipatuduhon marwarna bontar, jala daerah hidrofobik na gogo dipatuduhon marwarna oranye. (C dohot D) Protein-W na digambarkan di kartun, orientasi na sarupa songon na di (A) (C), jala diputar 180° (D). Domu tu posisi i urutan, residu na bisa ibedakon mangadopsi skema warna pelangi, i dia ujung N marwarna biru dot ujung C marwarna merah. (E) Protein-W di pandangan na sarupa songon di (A), jala sisa-sisa di antarmuka protein-W:LH1 digombarhon marhite batang na martanda na dipasang. (F) Protein-W diputar 90 ° martimbangkon (E) dohot LH1αβ14 di gambaran kartun, jala martimbangkon sisa antarmuka di gambaran batang. Sisa-sisa na marlojong sian polipeptida beta dibahen label. Kofaktor dipatuduhon songon batang na hombar tu warna ni Gambar 1, β-DDM na terurai dipatuduhon marwarna abu-abu, jala oksigen dipatuduhon marwarna merah. (G) Pandangan di (F) diputar 180°, dohot sisa-sisa na menonjol sian polipeptida alfa na marlabel.
Protein-W manggantihon sada heterodimer αβ (na pa-15-hon di Gambar 1F), marhite i mangambati panutupan lingkaran dohot miring tolu heterodimer αβ na parjolo. Diida do sudut kemiringan maksimal ni heterodimer αβ-1 na parjolo martimbangkon film normal ima 25° sahat tu 29° (Gambar 1, A dohot E), na dibentuk marhite kemiringan 2° sahat tu 8° ni αβ-1 di RC A kontras tajam-LH116 dohot F. Heterodimer paduahon dohot patoluhon miring 12° sahat tu 22° dohot 5° sahat tu 10°. Ala ni hambatan sterik ni RC, kemiringan ni αβ-1 ndang termasuk pasangan αβ paduahon (na hombar tu αβ ke-16 di Gambar 1F), gabe tubu ma celah na jelas di cincin LH1 (Gambar 1, A dohot E) . Alani hurang ni dua heterodimer αβ, didongani mago ni opat BChl dohot dua karotenoid, ndang adong sian karotenoid i na mangikat tu subunit αβ-1 na marputar, na manghorhon tu sada cincin LH114-W na marisi 13 karotenoid Vegetarian dohot 28 BChl. Perkiraan resolusi lokal ni dua kompleks di wilayah αβ1 sahat tu 7 umtoru sian sisa ni lingkaran LH1, na boi patuduhon plastisitas na melekat di subunit LH1 na mardomu tu situs QB RC (Gambar 4) .
Gambar ni RC-LH114-W (A dohot B) dohot RC-LH116 (C dohot D) dipatuduhon sian pandangan atas/pandangan samping na sarupa (A dohot B) (A dohot C) dohot permukaan rongga ni Gambar 1. (B dohot D). Kunci na marwarna dipatudu di siamun.
Sada-sadana kompleks inti na marciri na asing na marrasio stoikiometri 1:14 ima dimer RC-LH1-PufX (13). Tai, protein W dot PufX inda adong homologi na jelas, dot mardampak godang tu struktur LH1 masing-masing. PufX ima TMH tunggal dohot domain sitoplasma ujung N na marinteraksi dohot sisi sitoplasma subunit RC-H (13) di posisi na hombar tu Rps. 116αβ-16. PufX mambaen saluran tu pertukaran kinon/kinonlon antara RC-LH1 dot kompleks sitokrom bcl dot adong i sude Rba. kompleks inti ni bulung-bulung (13). Nang pe antarmuka monomer-monomer di Rba. Dimer sferoides RC-LH1-PufX maringanan di posisi pengikat protein W di RC-LH114-W, jala celah na dipicu PufX dohot protein-W di posisi na setara (Gambar S7A). Celah di RC-LH114-W pe sejajar do dohot saluran kinon hipotetis (8) ni Pseudomonas rosea LH1, na dibentuk ni peptida na so marpardomuan tu protein W manang PufX (Gambar S7B). Asing ni i, saluran kinon di Blc. LH1 na marwarna hijau zamrud na terbentuk marhite na mangacualihon sada subunit γ (7) maringanan di posisi na sarupa (Gambar S7C). Bope imediasi protein na marbeda, penampilan saluran kinon/kinolol on i posisi na sarupa i kompleks RC-LH1 songonna manjadi contoh evolusi konvergen, na manyatoon molo celah na ibuat protein W bisa martindak manjadi saluran kinon.
Celah i lingkaran LH114-W mamungkinkon pembentukan wilayah membran na torus-menerus antara ruang internal kompleks RC-LH114-W dot membran massal (Gambar 1G), dot inda manghubungkon dua domain lewat pori-pori protein songon i protein. Kompleks RC-LH116 sarupa do tu Tch na tertutup. Kompleks songon jarum (22) (Gambar 1H). Harana difusi kinon lewat membran lobi hatop tingon difusi lewat saluran protein na sompit, lingkaran LH114-W na tarbuka bisa mambaen perputaran RC lobi hatop tingon lingkaran LH116 na tartutup, dot difusi kinon tu RC bisa lobi tarbatas. Laho manguji manang na protein W manghorhon tu hamubaon ni kinon marhite RC, dibahen hami ma uji oksidasi sitokrom di konsentrasi tertentu ni ubikinon 2 (UQ2) (analog ni UQ10 alami na ihur isopren na jempek) (Gambar 2E). Nang pe hadirion ni kinon kelat mangambati penentuan na akurat ni konstanta Michaelis na tarida (RC-LH114-W dohot RC-LH116 cocok tu 0,2 ± 0,1 μM dohot 0,5 ± 0,2 μM, masing-masing), tingkat maksimal s-LH114-100. 28±5% umbalga sian rc-lh116 (3,6±0,1 e-rc-1 s-1).
Di mulana, diperkirahon hami do protein-W adong di hira-hira 10% sian kompleks inti (16); dison, tingkat penghunian sel pertumbuhan cahaya rendah, cahaya menengah, dohot cahaya tinggi masing-masing 15±0,6%, 11±1% dohot 0,9±0,5 % (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri massa patuduhon, penambahan tag histidin ndang mangurangi kelimpahan relatif ni protein-W dibandinghon tu galur tipe liar (P = 0,59), jadi tingkat on ndang artefak ni protein-W na dimodifikasi (Gambar S10). Alai, penghunian protein-W na rendah on di kompleks RC-LH1 boi mambahen pigapiga RC boi marbalik di kecepatan na dipercepat, marhite i mangurangi pertukaran kinon/kinonlon na lam lambat di kompleks RC-LH116. Diparrohahon hami do, tingkat penghunian cahaya na timbo ndang sadalan dohot data transkriptomik na baru-baru on, na patuduhon ekspresi gen pufW lam tamba di toru ni cahaya na gogo (Gambar S11) (23). Perbedaan antara transkripsi pufW dohot penggabungan protein-W tu kompleks RC-LH1 mambahen bingung jala boi do mancerminhon pangaturan na kompleks sian protein i.
Di RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) dohot 29 molekul β-DDM dialokasihon jala dimodelhon di bagasanna 6 CDL, 24 PoPC, 2 PoPGβDM dohot 12. RC-LH116 (Gambar 5, A dohot B). I dua struktur on, CDL ampir maringanan i sisi sitoplasma kompleks, sadangkan POPC, POPG dot β-DDM bahatan maringanan i sisi luminal. Dua molekul lipid dohot deterjen diisolasi di wilayah αβ-1 sahat tu αβ-6 kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), jala lima diisolasi di wilayah setara RC-LH116 (Gambar 5B ). Lebih bahat lipid na dapot di sisi na asing ni kompleks i, tarlumobi CDL, na marpungu di antara RC dohot αβ-7 sahat tu αβ-13 (Gambar 5, A dohot B). Lipid dot deterjen na lain na iselesaikan sacara struktural maringanan i luar cincin LH1, dot rantai asil na iselesaikan dohot denggan marpanjang antara subunit LH1, sementara itanda manjadi β-DDM i RC-LH114-W, dot iartikon manjadi β-DDM i RC A campuran βPOPC-HDLDM dot 66. Posisi na sarupa ni lipid kelat dohot deterjen di strukturta patuduhon na i ma inganan pengikat na relevan secara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul setara i Tch juo puna konsistensi na denggan. Lambok jala Trv. 970 RC-LH1s (Gambar S12, B sahat tu E) (9, 12) dohot sisa-sisa ikatan hidrogen ni kelompok ulu lipid patuduhon konservasi na cukup denggan di penjajaran urutan (Gambar S13), na patuduhon na CDL na dilestarihon na mangikat tu RC (24), situs-situs na dilestarihon di kompleks1.
(A dohot B) Peptida digombarhon marhite kartun, jala pigmen digombarhon marhite batang, mamangke skema warna di Gambar 1. Lipid dipatuduhon marwarna merah, jala deterjen dipatuduhon marwarna abu-abu. UQ na terikat tu situs RC QA dohot QB marwarna kuning, sedangkan UQ na terisolasi marwarna biru. (C dohot D) Sarupa do pandangan dohot (A) dohot (B), ndang dibahen lipid. (E sahat tu G) Dipabalga do pamerengan ni P1(E), P2(F) dohot P3(G) sian RC-LH116, marrante samping na masipengaruhan. Ikatan hidrogen ipatuduhon songon garis putus-putus na marwarna hitam.
I RC-LH116, baik RC QA dot QB UQ, na dohot i parpindahan elektron i proses pamisahan muatan, terurai i inganan pangikatna. Alai, di RC-LH114-W, ndang diselesaikan dope kinon QB jala diulas ma secara rinci di toru on. Asing ni kinon QA dohot QB, dua molekul UQ na markelat (na maringanan di holangholang ni cincin RC dohot LH1) dialokasihon di struktur RC-LH114-W hombar tu kelompok ulu na denggan diselesaikan (na maringanan di Q1 dohot Q2, masing-masing). ruang). Angka 5C). Dua unit isopren ditugashon tu Q1, jala peta kepadatan menyelesaikan 10 ihur isopren lengkap ni Q2. Di struktur RC-LH116, tolu molekul UQ10 na markelat (Q1 sahat tu Q3, Gambar 5D) diselesaikan, jala sude molekul i markepadatan na jelas di sandok ihur (Gambar 5, D sahat tu G). Di dua struktur i, posisi ni kelompok ulu ni Q1 dohot Q2 mansai denggan do konsistensina (Gambar S12F), jala holan marsaor do nasida dohot RC. Q1 maringanan di pintu masuk celah W ni RC-LH114-W (Gambar 1G dohot 5, C, D dohot E), jala Q2 maringanan jonok tu inganan pengikatan QB (Gambar 5, C, D) dohot F). Sisa L-Trp143 dohot L-Trp269 na dilestarihon mansai jonok tu Q1 dohot Q2 jala mangalehon potensi interaksi π-penumpukan (Gambar 5, E dohot F, dohot Gambar S12). L-Gln88, 3,0 Å sian oksigen distal Q1, mangalehon ikatan hidrogen na togu (Gambar 5E); sisa on dilestarihon di sude RC kecuali hubungan na paling dao (Gambar S13). L-Ser91 secara konservatif digantihon Thr di godangan RC na asing (Gambar S13), ima 3,8 angstrom sian metil oksigen Q1, jala boi mangalehon ikatan hidrogen na gale (Gambar 5E). Q3 ndang tarida adong interaksi na khusus, alai maringanan di daerah hidrofobik antara subunit RC-M dohot subunit LH1-α 5 sahat tu 6 (Gambar 5, D dohot G). Q1, Q2 dohot Q3 manang kinon kelat na jonok pe nunga diselesaikan di Tch. Lambok, Trv. Galur 970 dohot Blc. Struktur iris (9, 10, 12) manuju tu inganan pengikat kinon bantu na dilestarihon di kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Lima UQ na terurai di RC-LH116 denggan do sadalan dohot 5,8±0,7 ni ganup kompleks na ditontuhon marhite kromatografi cairan berkinerja tinggi (HPLC), sementara tolu UQ na terurai di RC-LH114-W umtoru sian Nilai diukur molekul 6,2±0,3 adong (Gbr. atakan.
Polipeptida L dohot M pseudo-simetris masing-masing marisi lima TMH jala mambahen heterodimer na padomuhon sada dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofag (BPh), dohot sada bosi non- Heme dohot sada manang dua molekul UQ10. Marhite hadirion ni ikatan hidrogen di gugus keton ujung dohot akumulasi na binoto di Rps, karotenoid dipamasuk tu subunit M, na margoar cis-3,4-dehidroorhodopin. Jenis (25). Domain selaput luar RC-H dijangkau tu selaput marhite sada TMH. Struktur RC keseluruhan sarupa dohot tolu subunit RC spesies na mardomu (songon Rba). sferoid (ID PDB: 3I4D). Makrosiklus BChl dohot BPh, tulang punggung karotenoid dohot bosi non-heme tumpang tindih di bagasan rentang resolusi ni struktur on, songon i nang kelompok ulu UQ10 di situs QA dohot kinon QB di RC-LH116 (Gambar S15).
Hadirion ni dua struktur RC na marasing tingkat penghunian situs QB mangalehon kesempatan na imbaru laho mamareso perubahan konformasi na konsisten na mandongani pengikatan kinon QB. Di kompleks RC-LH116, kinon QB maringanan di posisi “proksimal” na gok terikat (26), alai pemisahan ni RC-LH114-W ndang adong kinon QB. Dang adong kinon QB di RC-LH114-W, na mambahen longang roha ala kompleks i aktif, lobi sian kompleks RC-LH116 na markinon QB na terselesaikan secara struktural. Anggo dua cincin LH1 markelat sakitar onom kinon, lima tarselesaikon sacara struktural i cincin RC-LH116 na tartutup, sadangkan hum tolu tarbatas sacara struktural i cincin RC-LH114-W na tarbuka . Gangguan struktural na lam tamba on boi do patuduhon panggantian ni situs QB RC-LH114-W na lam hatop, kinetika kinon na lam hatop di kompleks i, jala lam godang do kemungkinan laho mamolus lingkaran LH1. Didok hami, hurang ni UQ di situs QB RC-LH114-W boi do hasil ni kompleks na lobi kompleks jala aktif, jala situs QB ni RC-LH114-W nunga pintor beku di perputaran UQ Tahap khusus (pintu masuk tu situs QB nunga ditutup a konformasi on) ref.
Molo so adong QB, rotasi na mandongani L-Phe217 tu posisi na so hombar tu pangikatan UQ10, ala gabe mambahen tabrakan spasial dohot unit isopren parjolo ni ihur (Gambar 6A). Asing ni i, jelas do perubahan konformasi utama na jelas, tarlumobi heliks de (heliks pendek di lingkaran antara TMH D dohot E) di dia L-Phe217 digeser tu kantong pengikat QB dohot rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A ) Laho mamutushon ikatan hidrogen dohot kerangka pengikat M54. situs (Gambar 6B). Heliks de marputar di dasarna, Cα ni L-Ser209 margeser 0,33Å, sementara L-Val221Cα margeser 3,52Å. Ndang adong perubahan na boi diida di TMH D dohot E, na boi martindih di dua struktur i (Gambar 6A). Sahat tu na taboto, on ma struktur na parjolo di RC alami na manutup situs QB. Perbandingan dohot struktur na lengkap (terikat QB) patuduhon molo kinon i diorui, porlu do parubahan konformasi asa boi masuk tu kinon. L-Phe217 marputar mambaen interaksi π-bertumpukan dohot kelompok ulu kinon, dot heliks margeser tu luar, mambaen rangka L-Gly222 dot rante samping L-Tyr223 mambaen jaringan ikatan hidrogen dohot struktur ikatan hidrogen na stabil (Gambar 6, A dot C).
(A) Kartun tumpang tindih struktur hologram (rantai L, rantai oranye/M, magenta) dohot apo (abu-abu), di na dipatuduhon angka sisa kunci i marrumanghon gambaran na songon batang. UQ10 digambarkan dohot batang na marwarna kuning. Garis titik-titik patuduhon ikatan hidrogen na tarbentuk di sude struktur. (B dohot C) Perwakilan permukaan ni apolipoprotein dohot sude struktur cincin, menyoroti oksigen rantai samping L-Phe217 na marwarna biru dohot L-Tyr223 na marwarna merah, masing-masing. Subunit L na marwarna oranye; subunit M dohot H ndang marwarna. (D dohot E) Situs QB RC apolipoprotein (D) dohot utuh (E) [warna dohot (A) masing-masing] dohot Termofil termofil PSII (hijau, biru dengan kinon plastik; ID PDB: 3WU2) Sejajarkan (58).
Na so panagaman, nang pe adong pigapiga struktur RC na hurang QB na so adong LH1, perubahan konformasi na diida di penelitian on ndang hea dibaritahon. Tarmasuk ma i struktur kehabisan QB sian Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) dohot Rba. (29), sudena i hampir sarupa dohot struktur QB secara keseluruhan. Molo dipareso sian 3PRC, diida ma molo molekul deterjen LDAO (Lauril Dimetil Amina Oksida) mangikat di pintu masuk ni posisi QB, na boi mangambati penataan kembali gabe konformasi na tertutup. Nang pe LDAO ndang terurai di posisi na sarupa di 1EYS manang 1OGV, RC on diparade mamangke deterjen na sarupa jala ala ni i boi do sarupa panghorhonna. Struktur kristal ni Rba. 1L9B) pe songon na adong do situs QB na tertutup. Alai, di bagasan on, daerah ujung N ni polipeptida RC-M (na marsaor dohot inganan pangikat QB marhite ikatan H ni sisa Tyr di heliks Q) mangadopsi konformasi na so alami, jala perubahan konformasi QB ndang disulingkiti lam tu dengganna (30 ). Na mambahen pos roha, ndang hea dope taida songon on deformasi ni polipeptida M di struktur RC-LH114-W, na hampir sarupa dohot daerah ujung N ni RC-LH116 RC. Siparrohahonon do muse, dung dihapus antena LH1 na marbasis deterjen, diselesaikan ma RC apolipoprotein di PDB, na mambahen mago angka kolam kinon parbagasan dohot lipid di celah antara RC dohot permukaan parbagasan ni cincin LH1 na humaliang (31, 32). RC tetap marfungsi ala dipertahanhon sude kofaktor, kecuali kinon QB na boi diurai, na hurang stabil jala jotjot mago di tingki proses persiapan (33). Asing ni i, diboto do molo panghapusan ni LH1 dohot lipid siklik alami sian RC boi marpanghorhon tu fungsi, isarana pajempek umur ni keadaan P + QB na dipisahhon muatan (31, 34, 35). Ala ni i, marspekulasi ma hami, hadirion ni cincin LH1 lokal na humaliang RC i boi do mampartahanhon situs QB na “tertutup”, marhite i boi do mampartahanhon lingkungan lokal na jonok tu QB i.
Anggo apolipoprotein (tanpa QB kinon) dot struktur lengkap manggombarkon hum dua jepretan tingon perputaran situs QB, dot inda rangkaian kajadian, adong indikasi molo pangikatan bisa ipagar giot mangambati pangikatan ulang ni hidrokinon Laho mangambati penghambatan substrat. Interaksi ni kinolol dohot kinon na jonok tu situs QB ni apolipoprotein boi do marasing, na mambahen ibana ditolak RC. Nunga leleng diusulhon molo parubahan konformasi marperan di pangikatan dohot pangurangan ni kinon. Kemampuan RC beku laho mangurangi kinon dung adaptasi na golap ganggu (36); Kristalografi sinar-X patuduhon, hasesega on ala ni kinon QB na tarhurung di konformasi “distal” hira-hira 4,5 Å sian posisi proksimal aktif (26) , 37). Didok ibana, “Apolipoprotein dohot struktur cincin lengkap, na mangihuthon interaksi awal dohot kinon dohot pembukaan situs QB.
RC tipe II na dapot di kompleks PSII ni bakteri fototrofik dohot bakteri siano tertentu, ganggang dohot suansuanan adong do pelestarian struktural dohot fungsina (38). Penjajaran struktural na dipatuduhon di Gambar 6 (D dohot E) mangondolhon sarupa ni RC PSII dohot situs QB ni kompleks RC bakteri. Parbandingan on madung lolot manjadi model tu mamparsiajari sistem na markaitan erat tingon pangikatan dot pangurangan kinon. Publikasi sebelumna mandok, perubahan konformasi didongani pangurangan PSII ni kinon (39, 40). Alani i, molo dipingkiri konservasi evolusi ni RC, mekanisme pengikatan na so hea diida on boi do muse marlaku tu situs QB ni PSII RC di suansuanan fototrofik na maroksigen.
Rps ΔpufW (penghapusan pufW tanpa label) dohot PufW-Nya (Ujung C 10x Protein-W na ditandai His na diekspresihon sian lokus pufW alami). Digombarhon do di ulaonta na salpu (16). Galur on dohot induk tipe liar isogenik dipulihkan sian kulkas beku marhite na manggaris-garis saotik sel di PYE (masing-masing 5 g liter -1) (disimpan di LB di suhu -80 °C, mengandung 50% ( w/v) protein gliserol, ekstrak ragi dohot suksinat (% agar). Pinggan i diinkubasi saborngin di na holom di suhu kamar di kondisi anaerob, dung i disondangi dohot cahaya na bontar (~50 μmolm-2 s-1) na diparade ni bohlam halogen OSRAM 116-W (RS Components, Inggris) saleleng 3 sahat tu 5 ari sahat tu na muncul sada koloni. Sada koloni dipangke laho maninokulasihon 10 ml media M22+ (41) na ditambahi dohot asam kasamino 0,1% (b/b) (na digoari muse M22). Budaya i ditubuhon di kondisi oksigen na rendah di na holom di suhu 34°C dohot digoyang-goyang di 180 rpm saleleng 48 jom, dung i 70 ml kultur i diinokulasihon di kondisi na sarupa saleleng 24 jom. Budaya setengah aerobik dengan volume 1 ml digunakan untuk menginokulasikan 30 ml media M22 di botol kaca tembus sekrup universal 30 ml dan disinari dengan agitasi (~50 μmolm-2 s-1) selama 48 jam dengan gaya magnet steril Batang pengaduk. Dung i 30 ml sian kultur i diinokulasi dohot hira-hira 1 liter kultur di kondisi na sarupa, na dung i dipangke laho maninokulasi hira-hira 9 liter kultur na diterangi di ~200 μmolm-2 s-1 saleleng 72 jom. Sel-sel i dipanen marhite sentrifugasi di 7132 RCF saleleng 30 menit, disuspensi muse di ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0), jala disimpan di suhu -20°C sahat tu na dihaporluhon.
Dung dicairkan, tambahon ma pigapiga kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggris), lisozim (Merck, Inggris) dohot dua tablet penghambat protease holoenzim Roche (Merck, Inggris) tu sel na disuspensi muse. Di sel tekanan Perancis na 20.000 psi (Aminco, Amerika Serikat), sel-sel i diganggu 8 sahat tu 12 hali. Dung dipadao sel na so putus dohot puing-puing na so larut marhite sentrifugasi di 18.500 RCF saleleng 15 menit di suhu 4°C, diendaphon ma membran sian lisaat na marpigmen marhite sentrifugasi di 113.000 RCF saleleng 2 jom di suhu 43.000 °C. Buang ma fraksi na larut jala disuspensihon ma muse selaput na marwarna i tu 100 sahat tu 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) jala homogenisasi ma sahat tu na so adong be agregat na tarida. Membran na tergantung i diinkubasi di bagasan tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, AS) na marisi 2% (b/v) β-DDM saleleng 1 jom di inganan na holom di suhu 4°C dohot diaduk lambok. Dung i, sentrifugal ma di suhu 70°C asa larut 150.000 RCF di suhu 4°C saleleng 1 jom laho mambuat sisa-sisa na so larut.
ml kolom pertukaran ion sepharose DEAE dengan tiga volume kolom penyangga pengikat [20 mM tris-HCl (pH 8,0) mengandung 0,03% (w/v) β-DDM]. Cuci ma kolom i dohot dua penyangga pengikat CV, dung i cuci ma kolom i dohot dua penyangga pengikat na marisi NaCl 50 mM. Kompleks RC-LH116 dielusi dohot gradien linier NaCl 150 sahat tu 300 mM (di penyangga pengikat) di 1,75 CV, jala kompleks pengikat na tading dielusi dohot penyangga pengikat na mengandung NaCl 300 mM di 0,5 CV. Papunguhon spektrum penyerapan antara 250 dohot 1000 nm, manjaga pecahan na marrasio penyerapan (A880/A280) lobi sian 1 di 880 sahat tu 280 nm, encerhon dua hali di penyangga pengikat, jala mamangke prosedur na sarupa muse di kolom DEAE On pemurnian. Encerhon ma angka pecahan na marrasio A880/A280 tumimbo sian 1,7 dohot rasio A880/A805 tumimbo sian 3,0, patupahon pertukaran ion putaran patoluhon, jala tahan ma angka pecahan na marrasio A880/A280 tumimbo sian 2,2 dohot rasio A880/A805 tumimbo sian 0. Kompleks na dimurnihon sebagian i dikonsentrasihon sahat tu ~2 ml di saringan sentrifugal cut-off berat molekul Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, Inggris), jala dimuat di kolom pengecualian ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, AS) na mengandung penyangga 200 m 1,5 CV. Papunguhon spektrum penyerapan ni fraksi pengecualian ukuran, jala papunguhon spektrum penyerapan dohot rasio A880/A280 lobi sian 2,4 dohot rasio A880/A805 lobi sian 5,8 sahat tu 100 A880, jala pintor pangke ma i tu persiapan manang penyimpanan kisi krio-TEM Simpan di -C°8.
Membran pelarutan dari galur PufW-His dilakukan ke kolom sefarosa 20 ml (pH 8,0) na mengandung NaCl 200 mM dan 0,03% (b/b)) di penyangga IMAC Kesehatan ( GE ). v) β-DDM]. Kolom i dicuci dohot lima CV penyangga IMAC, dung i dohot lima CV penyangga IMAC na marisi histidin 10 mM. Kompleks inti dielusi sian kolom dohot lima penyangga IMAC na marisi histidin 100 mM. Fraksi na marisi kompleks RC-LH114-W dikonsentrasihon sahat tu ~10 ml di bagasan tangki na diaduk na dilengkapi dohot saringan Amicon 100.000 MWCO (Merck, Inggris), diencerkan 20 hali dohot penyangga pengikat, dung i ditambahhon tu 25 ml penyangga DEAE b di jolo. Cuci ma kolom i dohot opat penyangga pengikat CV, dung i elusi ma kompleks i di ualu CV di gradien linier NaCl 0 sahat tu 100 mM (di penyangga pengikat), jala opat CV na tading i marisi rasio penyangga pengikat 100 mM Kompleks sisa na dielusi di natrium8A20. ml di saringan sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, jala diisi dohot 1,5 CV IMAC di jolo Penyangga diseimbangkan Superdex 200 di atas penyangga 16/60 1,5 CV. Papunguhon spektrum penyerapan ni angka pecahan ukuran-pengecualian jala papunguhon spektrum penyerapan dohot rasio A880/A280 lobi sian 2,1 dohot rasio A880/A805 lobi sian 4,6 sahat tu 100 A880, na pintor dipangke tu persiapan kisi TEM beku manang disimpan di porlu sahat tu -80°C.
Dipangke ma beku perendaman Leica EM GP laho paradehon kisi-kisi TEM suhu rendah. Kompleks i diencerkan di penyangga IMAC tu A880 sian 50, dung i 5μl dimuat tu jala tembaga na baru dibuang cahaya 1,2/1,3 na marlapis karbon (Agar Ilmiah, Inggris). Inkubasi ma kisi-kisi i di suhu 20°C dohot kelembaban relatif 60% saleleng 30 s, dung i dibahen ma asa kering saleleng 3 s, dung i dipamate ma i di bagasan etan cair di suhu -176°C.
Data ni kompleks RC-LH114-W dicatat di eBIC (Pusat Bioimaging Elektronik) (Sumber Cahaya Berlian Inggris) dohot mikroskop Titan Krios, na mangula di tegangan percepatan 300kV, dohot pembesaran nominal Choose energi 130.000 gap a-2. Dipangke ma sada kuantum GIF Gatan 968 dohot detektor puncak K2 laho mancatat gambar di bagasan mode penghitungan laho papunguhon data. Ukuran piksel na dikalibrasi ima 1,048 Å, jala tingkat dosis 3,83 e-Å-2s-1. Dipapungu ma film i di bagasan 11 detik jala dibagi gabe 40 bagian. Pangke ma inganan na marlapis karbon i laho mambahen mikroskop i fokus muse, dung i papungu ma tolu film di ganup lubang. Sacara total, 3130 film ipapungu, dohot nilai defokus antara -1 dot -3μm.
Data tu kompleks RC-LH116 ipapungu mamakke mikroskop na sarupa di Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data ipapungu i mode paretongan dohot pembesaran 130 k, dot ukuran piksel ikalibrasi manjadi 1,065 Å dohot dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film on direkam di bagasan 12 detik jala dibagi gabe 48 bagian. Saluhutna, 3359 film na dipungu, dohot nilai defokus antara -1 dohot -3μm.
Sude pengolahan data diulahon di pipa Relion 3.0 (42). (43) laho paturehon gerak balok marhite pembobotan dosis, dung i pangke ma CTFCARI 4.1 (44) laho manontuhon parameter CTF (fungsi perpindahan kontras). Fotomikrograf khas dung tahap pengolahan awal on dipatuduhon di Gambar 2. S16. Cetakan pamilihan otomatis ihasilkon dohot mamilih manual sakitar 250 piksel tingon 1000 partikel i bingkai 250 piksel dot inda adong acuan klasifikasi dua dimensi (2D), marhite i manulak angka klasifikasi na memenuhi kontaminasi sampel sanga inda adong ciri-ciri na tarida. Dung i, dibahen ma pemilihan otomatis tu sude foto mikro, jala 849.359 partikel ma RC-LH114-W, jala kompleks RC-LH116 476.547 partikel. Sude partikel na tarpillit nunga mangadopi dua putaran klasifikasi 2D non-acuan, jala dung ganup mardalan, partikel na pajumpang dohot luas karbon, pencemaran sampel, ndang adong fitur na jelas manang partikel na tumpang tindih na gogo ditolak, manghorhon 772.033 (90,9%) dohot 359.678 partikel pangkeon ni partikel3. RC-LH114-W dohot RC-LH116 masing-masing. Model acuan 3D awal dihasilhon mamangke metode turunan gradien stokastik. Manggunaon model awal manjadi acuan, partikel-partikel na tarpili ibagi manjadi opat kategori i 3D. Dipangke ma model di kategori on songon acuan, diulahon ma pemurnian 3D tu partikel-partikel di kategori na umbalga, dung i dipangke ma saring-saring lulus rendah 15Å awal laho manutup luat pelarut, ditambahon ma 6 piksel pinggir na lambok, jala diproses ma piksel-piksel i laho paturehon fungsi transfer Gatan K2 puncak Mok. 114-W, model awal on dimodifikasi marhite na padaohon kepadatan na gogo di pinggir ni topeng (diputushon sian kepadatan kompleks inti di Chimera UCSF). Model na ihasilkon (resolusi RC-LH114-W dot RC-LH116 masing-masing ima 3,91 dot 4,16 Å) ipake manjadi acuan tu putaran padua klasifikasi 3D. Partikel na ipake ikelompokkon tu kelas 3D awal dot inda marisi korelasi na kuat dohot lingkungan. Tumpang tindih manang hurang fitur struktural na jelas. Dung putaran paduahon klasifikasi 3D, dipillit ma kategori na marresolusi na tumimbo [Di RC-LH114-W, sada kategori ima 377.703 partikel (44,5%), di RC-LH116, adong dua kategori molo dison holan 260.752 partikel do. dung rotasi awal dohot perbedaan na metmet]. Partikel na tarpillit i diekstraksi muse di bagasan kotak 400 piksel jala dimurnihon marhite pemurnian 3D. Topeng pelarut dihasilhon mamangke saringan lulus rendah 15Å awal, ekspansi peta 3 piksel dohot topeng lambok 3 piksel. Manggunahon pemurnian CTF per partikel, koreksi gerak per partikel dohot putaran paduahon pemurnian CTF per partikel, pemurnian 3D, penyamakan pelarut dohot pasca pengolahan diulahon dung ganup langkah laho lam padengganhon tekstur na dihasilhon. Manggunahon nilai potong FSC (Koefisien Korelasi Cangkang Fourier) 0,143, resolusi ni model akhir ni RC-LH114-W dohot RC-LH116 masing-masing 2,65 dohot 2,80Å. Kurva FSC model akhir dipatuduhon di Gambar 2. S17.
Sude urutan protein diunduh sian UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID UniProtein: Q6N1K3). Dipangke ma model homologi ni RC, na marisi urutan protein ni RC-L, RC-M dohot RC-H dohot struktur kristal ni Rba. RC dipangke gabe cetakan (ID PDB: 5LSE) (46). Pake ma alat “peta pas” di Chimera UCSF asa pas model na dihasilhon tu peta (47), paturehon struktur protein, dohot kofaktor [4×BChl a (nama residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), sada manang dua jenis UQ10 (U10), sada iron non-heme) 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] pake Coot (48) laho manambai. Ala ndang adong QAK di perpustakaan monomer, diparameterhon ma i mamangke alat eLBOW di PHENIX (49).
Dung i, dipajongjong ma subunit LH1. Di mulana, alat pembangunan otomatis di PHENIX (49) dipangke laho mambangun bagian ni urutan LH1 secara otomatis mamangke peta dohot urutan protein LH1-α dohot LH1-β songon masukan. Pillit ma subunit LH1 na paling lengkap, ekstrak jala muat ma tu Coot, tambahon ma urutan na hurang di bagasanna secara manual, jala perbaiki ma sude struktur i andorang so ditambahon dua BCl a (BCL) dohot sada spiriloksantin (CRT) [sesuai Rps yang bersangkutan Kepadatan kompleks LH1 dan kandungan karotenoid na binoto. Jenis (17)]. Salin ma subunit LH1 na lengkap, jala pangke ma “Alat Peta Dok” Kimera UCSF laho marlabuh di daerah non-model na mardomu tu kepadatan LH1, dung i diperbaiki ma i di Coot; ulahon ma proses i sahat tu na sude subunit LH1 nunga dimodelhon. Anggo struktur RC-LH114-W, dohot mangekstraksi kepadatan na inda dialokasikon i Coot, protein i dibagi tingon komponen non-protein na tading i peta Chimera USCF dot alat Autobuild ipake giot pajongjongkon model awal, dot subunit na tading (protein-W) Pemodelan. Di PENIS (49). Tambahon ma urutan na hurang tu model na dihasilhon di Coot (48), dung i, padenggan ma sude subunit i secara manual. Kepadatan na so dialokasihon na tading i pas do tu kombinasi ni lipid (ID perpustakaan monomer PDB ni CDL = CDL, POPC = 6PL dohot POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) dohot molekul UQ10 (U10). Pake ma optimasi PHENIX (49) dohot optimasi manual di Coot (48) laho menyempurnakan model awal na lengkap sahat tu na ndang boi lam denggan statistik model dohot kualitas visual ni pas i. Na parpudi, pangke ma Skala Loc (50) laho mangasah peta lokal, dung i patupa ma pigapiga siklus na asing laho mamodelhon kepadatan na so dialokasihon dohot optimasi otomatis dohot manual.
Peptida, kofaktor dohot lipid dohot kinon na asing na marlabuh di bagasan kepadatanna be dipatuduhon di Gambar 1 dohot 2. S18 sahat tu S23. Hatorangan statistik ni model akhir dipatuduhon di Tabel S1.
Molo so adong na asing, spektrum penyerapan UV/Vis/NIR dipungu di spektrofotometer Cary60 (Agilent, AS) di selang 1 nm sian 250 nm sahat tu 1000 nm dohot tingki integrasi 0,1s.
Encerkan sampel di kuvet kuarsa dengan jalur 2 mm tu A880 sian 1, jala papunguhon spektrum penyerapan antara 400 dohot 1000 nm. Spektrum dikroik melingkar dikumpulkan di spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) di jarak 1 nm antara 400 nm dohot 950 nm di kecepatan pindai 20 nm min-1.
Koefisien kepunahan molar ditontuhon marhite na mangancerhon kompleks inti tu A880 hira-hira 50. Encerkan volume 10μl di penyangga pengikat manang metanol 990μl, jala pintor papunguhon spektrum penyerapan asa boi meminimalkan degradasi BChl. Kandungan BChl ni ganup sampel metanol dietong marhite koefisien kepunahan di 771 nm 54,8 mM-1 cm-1, jala ditontuhon koefisien kepunahan (51). Dibagi ma konsentrasi BChl na diukur tu 32 (RC-LH114-W) manang 36 (RC-LH116) laho manontuhon konsentrasi kompleks inti, na dung i dipangke laho manontuhon spektrum penyerapan sampel na sarupa na dipapungu di penyangga Koefisien Kepunahan. paralel. Tolu hali diulahi pangukuran tu ganup sampel, jala rata-rata penyerapan maksimum BChl Qy dipangke laho mangetong. Koefisien kepunahan RC-LH114-W na diukur di 878 nm ima 3280±140 mM-1 cm-1, sedangkan koefisien kepunahan RC-LH116 na diukur di 880 nm ima 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 diukur hombar tu metode di (52). Singkatna, dibahen ma HPLC fase terbalik (RP-HPLC) mamangke sistem HPLC Agilent 1200. Larutkan sekitar 0,02 nmol RC-LH116 atau RC-LH114-W dalam 50μl metanol:kloroform 50:50 na mengandung 0,02% (b/v) klorida besi, dan suntikkan pra-seimbangkan di m1 40°C di pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) di kolom ×25 cm. Dibahen ma eluasi isokratik di bagasan pelarut HPLC laho mangawasi absorbansi di 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) dohot 780 nm (BChl) saleleng 1 jom. Puncak di kromatogram 275 nm di 25,5 menit diintegrasihon, na so marisi senyawa na asing na boi dideteksi. Luas terpadu dipangke laho mangetong jumlah mol UQ10 na diekstraksi marguru tu kurva kalibrasi na dietong sian suntikan baku murni sian 0 sahat tu 5,8 nmol (Gambar S14). Ganup sampel dianalisis di bagasan tolu hali, jala kesalahan na dilaporkan hombar tu SD ni rata-rata.
Larutan na marisi kompleks RC-LH1 dohot penyerapan Qy maksimal 0,1 diparade dohot 30 μM sitokrom jantung kuda na dikurangi c2 (Merck, Inggris) dohot 0 sahat tu 50 μMUQ2 (Merck, Inggris). Tolu sampel 1 ml diparade di ganup konsentrasi UQ2 jala diinkubasi saborngin di na holom di suhu 4°C asa boi lengkap adaptasi tu na holom andorang so diukur. Larutan i dimuat tu spektrofotometer modular OLIS RSM1000 na dilengkapi dohot kisi-kisi api/500 garis 300 nm, celah masuk 1,24 mm, celah tengah 0,12 mm dohot celah kaluar 0,6 mm. Saringan lulus ganjang 600 nm dibahen di pintu masuk ni tabung foto sampel dohot tabung fotoperkali acuan laho mangambolongkon cahaya eksitasi. Serapan dipantau di 550 nm dohot waktu integrasi 0,15 s. Cahaya eksitasi i dipancarhon sian LED M880F2 880 nm (Dioda Pemancar Cahaya) (Thorlabs Ltd., Inggris) marhite kabel serat optik na margogo 90% marhite kontroler DC2200 (Thorlabs Ltd., Inggris) jala dipancarhon tu sumber cahaya di sudut 9°. Balok pangukuran i maralo tu sorminan giot paulakkon panondang sanga aha na inda iserap sampel i mulana. Pantau ma penyerapan 10 s andorang so penerangan 50 s. Dung i, dipamanat ma muse serap i saleleng 60 s di na holom laho menilai sahat tu dia do kinolol secara spontan mangurangi sitokrom c23 + (ida Gambar S8 tu data mentah).
Data i diolah marhite na pas tingkat awal linier di bagasan 0,5 sahat tu 10 s (tergantung tu konsentrasi UQ2) jala rata-rata tingkat ni sude tolu sampel di ganup konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 na dietong dohot koefisien kepunahan masing-masing dipangke laho mangubah tingkat gabe efisiensi katalitik, diplot di Origin Pro 2019 (OriginLab, AS), jala dipasang tu model Michaelis-Menten laho manontuhon nilai Km dohot Kcat na tarida.
Di pangukuran penyerapan sementara, sampel RC-LH1 diencerkan sahat tu ~ 2 μM di penyangga IMAC na mengandung 50 mM natrium askorbat (Merck, AS) dohot 0,4 mM Terbutin (Merck, AS). Asam askorbat ipake manjadi donor elektron pengorbanan, dot tert-butaklofen ipake manjadi penghambat QB giot mamastihon donor RC utama totop markurang (ima, inda fotooksidasi) sapanjang proses pangukuran. Hira-hira 3 ml sampel ditambahon tu sel na marputar khusus (hira-hira 0,1 m diameterna, 350 RPM) dohot ganjang ni jalur optik 2 mm laho mamastihon sampel di jalur laser adong tingki na tuk tu adaptasi na holom di antara pulsa eksitasi. Pake ma pulsa laser ~100-fs laho mampargogoi sistem laser Ti: Safir (Spektra Fisika, Amerika Serikat) laho manghehehon sampel di 880 nm di tingkat pangulangan 1 kHz (20 nJ tu NIR manang 100 nJ tu Vis). Andorang so papunguhon data, dibahen ma sampel i tu cahaya eksitasi hira-hira 30 menit. Pamaparan i mambahen QA inaktif (mungkin mangurangi QA sahali manang dua hali). Alai parrohahon ma, proses on boi do dibalik ala dung leleng masa adaptasi na holom, lam leleng ma RC mulak tu kegiatan QA. Spektrometer Helios (Sistem Ultracepat, Amerika Serikat) dipangke laho mangukur spektrum parsatongkinan dohot tingki penundaan -10 sahat tu 7000 ps . Pangke ma perangkat lunak Surfast Xplorer (Sistem Ultrafast, Amerika Serikat) laho mambungka punguan ni angka data i, dung i padomu jala dibahen standar. Dipangke ma paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) laho mamangke kumpulan data na digabung laho mandapot spektrum diferensial na marpardomuan tu peluruhan, manang mamangke fungsi na mangalibathon pigapiga eksponen dohot tanggapan ni alat asa pas tu evolusi spektral panjang gelombang tunggal di Asal (Asal, Amerika Serikat).
Songon na nidok nangkin (53), diparade ma film fotosintesis na marisi kompleks LH1 na hurang antena RC dohot antena LH2 tepi. Membran i diencerkan dohot tris 20 mM (pH 8,0) dung i di muat tu kuvet kuarsa na marjalur optik 2 mm. Dipangke ma pulsa laser 30nJ laho menghibur sampel di 540 nm dohot waktu penundaan -10 sahat tu 7000 ps. Olah punguan data songon na digombarhon tu Rps. pal contohna.
Membran i dipelet marhite sentrifugasi di 150.000 RCF saleleng 2 jom di suhu 4°C, dung i serapna di 880 nm disuspensi muse di tris-HCl 20 mM (pH 8,0) dohot NaCl 200 mM. Larutkan ma selaput i marhite na mangaduk nanget-nanget di bagasan β-DDM 2% (b/v) saleleng 1 jom di inganan na holom di suhu 4°C. Sampel diencerkan dalam 100 mM trietilammonium karbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, Inggris) sahat tu konsentrasi protein 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Dibahen ma pengolahan selanjutna sian metode naung diterbithon najolo (54), dimulai sian pengenceran protein 50 μg gabe godang ni 50 μl TEAB na marisi 1% (b/v) natrium laurat (Merck, Inggris). Dung sonikasi saleleng 60 s, diorui ma i dohot tris (2-karboksietil) fosfin (Merck, Inggris) 5 mM di suhu 37 ° C saleleng 30 menit. Molo S-alkilasi, inkubasi ma sampel i dohot metil S-metiltiometansulfonat 10 mM (Merck, Inggris) jala tambahon ma i sian larutan saham isopropanol 200 mM saleleng 10 menit di suhu kamar. Pencernaan proteolitik dilakukan dengan menambahkan 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 jam. Surfaktan laurate diekstraksi marhite na manambai 50 μl etil asetat dohot 10 μl asam trifluorasetat kelas LC (TFA; Pemisahan fase dipromosihon marhite sentrifugasi di 15.700 RCF saleleng 5 menit. Mangihuthon protokol ni pabrik, dipangke ma kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Inggris) laho manat mangaspirasi dohot mambuang garam sian fase na di toru na marisi peptida i. Dung dikeringkan dengan sentrifugasi vakum, sampel dilarutkan di bagasan TFA 0,5% dohot asetonitril 3%, jala 500 ng dianalisis marhite kromatografi RP aliran nano ditambah spektrometri massa mamakke parameter sistem naung dirinci di jolo.
(56) laho mananda dohot mangukur protein laho mangalului Rps. basis data proteom bulung-bulung (proteom). Data proteomik spektrometri massa nunga disimpan di Aliansi Pertukaran Proteome marhite gudang mitra PRIDE (
Dibahen ma kompleks RC-LH1 sian Rps tipe liar. Dipangke ma metode naung diterbithon najolo (16), konsentrasi protein na dihasilhon di sel palustris ima 2 mg ml-1 di Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM dohot 0,03% (b/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Menurut protokol pabrik, pake ma alat pemurnian 2D (GE Healthcare, AS) laho mangaruarhon 10 μg protein marhite cara pengendapan, jala larutkan endapan i di bagasan 20 μl asam formik (FA), 20% (v/v) Asetonitril dohot 20% air (v/v). Lima mikroliter dianalisis marhite RPLC (Dionex RSLC) ditambah dohot spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). 100 μlmin -1, dengan gradien 85% (v / v) pelarut A Manggunahon sumber ionisasi elektrosemprot standar dohot parameter bawaan lobi sian 60 menit, spektrometer massa mandapot 100 sahat tu 2750 m/z (rasio massa-tu-muatan). Marhite pangurupion ni alat FindPept portal sumber daya bioinformatika ExPASy, dipetahon ma spektrum massa tu subunit ni kompleks i.
Sel-sel i ditubuhon saleleng 72 jom di toru ni 100 ml cahaya NF-rendah (10 μM-2 s-1), menengah (30 μM-2 s-1) manang na timbo (300 μM-2 s-1). Media M22 (media M22 di na dihalupahon amonium sulfat jala diganti natrium suksinat dohot natrium asetat) di bagasan botol sekrup 100 ml (23). I lima siklus 30-s, manik-manik kaca 0,1 mikron i manik-manikkon i rasio volume 1:1 giot malisis sel-sel dot ipadinginkon i es salaos 5 menit. Bahan na so larut, sel na so putus dohot manik-manik kaca dipadao marhite sentrifugasi di 16.000 RCF saleleng 10 menit di mikrosentrifugas bangku. 100.000 RCF di tris-HCl 20 mM (pH 8,0) dohot gradien sukrosa 40/15% (b/b) saleleng 10 jom.
Songon naung pinatorang di ulaonta na salpu, imunodeteksi tag Na di PufW (16). Singkatna, kompleks inti na dimurnihon (11,8 nM) manang membran na marisi konsentrasi RC na sarupa (ditontuhon marhite oksidasi mangurangi spektrum perbedaan na moru jala cocok tu beban di gel na marwarna) di penyangga pemuatan SDS 2x (Merck, Inggris) diencerkan dua hali. Protein i dipisahkon i gel NuPage bis-tris replika 12% (Thermo Fisher Ilmiah, Inggris). Sada gel diwarnai dohot biru cemerlang Coomassie (Bio-Rad, Inggris) laho mamuat dohot mambahen gambaran subunit RC-L. Protein na di gel paduahon i dipindahon tu membran poliviniliden fluorida (PVDF) na diaktifhon metanol (Thermo Fisher Ilmiah, Inggris) laho manguji imunoassay. Membran PVDF diblokir dalam tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, susu bubuk 0,2% (v/v) Tween-20 dan 5% (b/v), kemudian diinkubasi dengan antibodi primer anti-His (dalam penyangga tris-HCl m0l 7,6), NaCl 150 mM dohot 0,05% (v/v) Tween-20] di bagasan 1:1000 A190-114A, Laboratorium Betil, Amerika Serikat) saleleng 4 jom. Dung dicuci 3 hali saleleng 5 menit di penyangga antibodi, membran i dipadomu dohot antibodi sekunder anti tikus lobak (diencerkan 1:10.000 di penyangga antibodi) (Sianagen, Italia) dohot Pencitraan 600 (Perawatan Kesehatan GE, Inggris).
57) Olah ma gambar i. Rasio-rasio on diubah gabe rasio molar marhite na mangasumsihon rasio RC-L tu protein-W di sampel RC-LH114-W murni 1:1 jala dinormalhon sude kumpulan data hombar tusi.
Molo naeng mandapot bahan tambahan tu artikel on, ida ma di http://www.
On ma sada artikel akses terbuka na dibagihon hombar tu ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel on boi dipangke, dibagihon, jala dibahen muse ndang marbatas di media na dia pe, asal ma denggan dikutip karya aslina.
Catatan: Holan mangido do hami asa dilehon hamu alamat emailmuna asa diboto halak na disaranhon hamu tu halaman i na lomo rohamuna mangida email i jala ndang spam. Ndang na laho manangkap hami alamat email.
Sungkunsungkun on dipangke laho manguji molo hamu pengunjung jala mangambati pengajuan spam otomatis.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F.
Struktur resolusi tinggi kompleks jebakan cahaya 1 i pusat reaksi mangalehen wawasan na baru tu dinamika kinon.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F.
Struktur resolusi tinggi kompleks jebakan cahaya 1 i pusat reaksi mangalehen wawasan na baru tu dinamika kinon.
©2021 Punguan Amerika tu Kemajuan Ilmu Pengetahuan. sude hak dijaga. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, CrossRef dan COUNTER. 2375-2548.