Saonari *Alamat saonari: Köln 50931, Jerman, Penelitian Klaster Keunggulan Köln taringot tu Tanggapan Stres Seluler di Penyakit na Marpardomuan tu Penuaan (CECAD).
Degenerasi saraf ni sahit mitokondria ianggap inda bisa ibalik harana plastisitas metabolisme saraf tarbatas, tai efek disfungsi mitokondria tu otonomi sel metabolisme saraf i pamatang inda ipahami. Dison, hami patandahon proteom spesifik sel ni saraf Purkinje na markekurangan OXPHOS na lam tu majuna ala ni dinamika fusi mitokondria na terganggu. Didapot hami do molo disfungsi mitokondria mamicu parubahan na bagas di bidang proteomik, ujungna manghorhon tu aktivasi na marturut-turut sian program metabolisme na tepat andorang so mate sel. Di na so panagaman, ditontuhon hami do induksi na jelas sian piruvat karboksilase (PCx) dohot peroksidase na asing na marpardomuan tu na manambai perantara siklus TCA. Panghambatan ni PCx mambahen lam parah stres oksidatif dohot degenerasi saraf, na patuduhon molo aterosklerosis marpanghorhon na mangalinggomi di saraf na hurang OXPHOS. Pemulihan fusi mitokondria i neuron na mardegradasi ujungna sacara lengkap mambalikkon parange metabolisme on, dohot i mangambati hamatean sel. Hatorangan nami mananda jalur na so binoto najolo na mangalehon ketahanan tu disfungsi mitokondria jala patuduhon na degenerasi saraf boi dibalik nang pe di tahap akhir ni sahit i.
Peran sentral mitokondria i manjago metabolisme energi saraf iondolkon dohot gejala saraf na luas na markaitan dohot sahit mitokondria jolma. Godangan sian sahit on dibahen mutasi gen na mangatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) manang hasesega ni gen na marpardomuan tu dinamika mitokondria, na secara tidak langsung mempengaruhi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Ulaon di model binatang nunga patuduhon molo mangalusi disfungsi mitokondria di jaringan na humaliang, jalur metabolisme konservatif (5-7) boi diaktifhon, gabe mangalehon wawasan na ringkot tu patogenesis ni angka sahit na kompleks on. Imbar ni i, pangantusionta taringot tu parubahan metabolisme ni jenis sel tertentu na dibahen kegagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak, i ma na mendasar (8), na mangondolhon ringkot ni mananda sasaran terapi na boi dipangke laho mangambati manang mangambati sahit. Mangambati sahit saraf (9). Hurang ni hatorangan ima kenyataan na sel saraf dianggap luas memiliki fleksibilitas metabolisme na mansai terbatas dibandinghon tu jenis sel jaringan na humaliang (10). Dilehon molo sel-sel on berperan sentral di na mengkoordinasikan pasokan metabolit tu saraf laho mendorong transmisi sinaptik dohot merespon kondisi luka dohot sahit, kemampuan laho menyesuaihon metabolisme sel tu kondisi na menantang jaringan otak hampir terbatas tu sel glial (11-14). Salain i, heterogenitas sel na melekat i jaringan otak godang mangambati studi parubahan metabolisme na tarjadi i subkelompok saraf tartontu. Alani i, ndang godang na binoto taringot tu akibat seluler dohot metabolisme na tangkas sian disfungsi mitokondria di saraf.
Asa boi mangantusi konsekuensi metabolisme ni disfungsi mitokondria, hami mangisolasi saraf Purkinje (PN) di tahap na marasing sian degenerasi saraf na dibahen hasesega ni fusi selaput luar mitokondria (Mfn2). Nang pe mutasi Mfn2 di jolma marpardomuan tu sada bentuk neuropati sensorik motorik turun-temurun na ditanda songon Charcot-Marie-Gigi tipe 2A (15), hasesega kondisional ni Mfn2 di tikus ima induksi disfungsi oksidasi Fosforilasi (OXthoPHD) na diakui dohot denggan. Marragam subtipe saraf (16-19) dohot fenotipe saraf na dihasilhon didongani gejala saraf na lam tu majuna, songon gangguan gerak (18, 19) manang ataksia otak (16). Marhite na mamangke kombinasi ni proteomik bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, dohot metode virusologis, tapatuduhon do na degenerasi saraf na lam tu majuna mansai gogo manginduksi piruvat karboksilase (PCx) dohot angka faktor na asing na tarlibat di arteriosklerosis PN di vivo Ekspresi ni enzim. Laho mamastihon relevansi ni dapot on, secara khusus hami mangatur ekspresi ni PCx di PN na hurang Mfn2, jala dapot hami do operasi on mambahen lam parah stres oksidatif dohot mempercepat degenerasi saraf, marhite i mambuktihon na azoospermia mangalehon hamatean sel Kemampuan beradaptasi metabolisme. Ekspresi na parah sian MFN2 boi sadenggan-dengganna paluahon degenerasi terminal PN dohot defisiensi OXPHOS na parah, konsumsi DNA mitokondria na godang, jala rupana jaringan mitokondria na putus, na lobi mangondolhon molo bentuk degenerasi saraf on bahkan boi do malum di tahap lanjut ni sahit sel taon.
Dibahen ibana ma sada galur tikus na mambahen mitokondria na margantung tu Cre boi manarget ekspresi Cre jala dipareso morfologi mitokondria di vivo. Didapot hami do molo sega gen Mfn2 di PNs, gabe martahap ma jaringan mitokondria (Gambar S1A), jala perubahan na parjolo didapot di umur 3 minggu. Sebalikna, degenerasi na balga di lapisan sel PN, songon na dibuktihon marhite mago ni imunowarna Calbindin, ndang dimulai sahat tu umur 12 minggu (Gambar 1, A dohot B). Ndang sadalan tingki antara parubahan morfologi mitokondria na parjolo dohot parmulaan ni hamatean ni saraf na tarida mambahen hami laho manyalidiki parubahan metabolisme na dipicu disfungsi mitokondria andorang so hamatean sel. Dibahen hami ma sada strategi berbasis penyortiran sel na diaktifhon pendar (FACS) laho mangisolasi PN na mengekspresikan YFP (YFP +) (Gambar 1C), dohot di tikus kontrol (Mfn2 + / loxP :: Optimalisasi strategi gerbang na marojahan tu intensitas relatif ni sinyal YFP mambahen hita boi mamurnihon badan YFP + (YFPhigh) ni PN sian non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) manang pecahan akson / dendritik neon na diduga (Gambar S1D, kiri). Dibahen ma proteomik LFQ dung i analisis komponen utama, jala dapot ma adong pemisahan na jelas antara sel YFPhigh dohot YFPneg (Gambar S1C). 21, 22), alai ndang adong pengayaan protein na somal diekspresihon di neuron manang jenis sel na asing (Gambar 1D) ). Perbandingan antara sampel di sel YFPhigh na tergolong na dipungu di percobaan mandiri patuduhon koefisien korelasi> 0,9, patuduhon reproduksi na denggan antara ulangan biologis (Gambar S1E). Singkatna, data on mambahen sah rencana nami tu isolasi akut dohot spesifik ni PN na layak. Ala sistem supir L7-cre na dipangke manginduksi rekombinasi mosaik di minggu parjolo dung parsorang (23), mulai ma hami mambunu tikus sian CTRL jala bersyarat ( Dung sidung rekombinasi, idokon ma Mfn2cKO i umur 4 minggu. Songon titik ujung, hami mamillit umur 8 minggu tingki lapisan PN utuh dope nang pe jelas angka serpihan mitokondria (Gambar 1B dohot Gambar S1A). Dipaboa hami ma godangna 3013 protein, sian i hira-hira 22% marojahan tu anotasi MitoCarta 2.0 na marojahan tu proteom mitokondria songon mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial na diulahon di minggu 8 patuduhon holan 10,5% sian sude protein na adong perubahan na signifikan (Gambar 1F dohot Gambar S1F), sian i 195 protein diatur tu toru jala 120 protein diatur tu ginjang (Gambar 1F). Siparrohahonon do, “analisis jalur inovatif” ni punguan data on patuduhon, gen na diekspresihon secara berbeda terutama masuk tu punguan jalur metabolisme tertentu na terbatas (Gambar 1G). Na menarik, nang pe pangaturan tu toru ni jalur na marpardomuan tu OXPHOS dohot sinyal kalsium patoguhon induksi disfungsi mitokondria di PN na hurang fusi, kategori na asing na utamana mangalibathon metabolisme asam amino secara signifikan diatur tu ginjang, na sadalan tu metabolisme mitokondria P na masa. Kabel ulang na marsihohot. ndang marfungsi.
(A) Foto konfokal perwakilan bagian otak tikus CTRL dohot Mfn2cKO na patuduhon mago ni PN na lam tu majuna (kalbindin, abu-abu); inti diwarnai dohot DAPI. (B) Kuantifikasi (A) (analisis varians satu arah, *** P <0,001; n = 4 sahat tu 6 lingkaran sian tolu tikus). (C) Alur kerja percobaan. (D) Peta panas parserahan ni penanda na khusus tu Purkinje (ginjang) dohot jenis sel na asing (tonga). (E) Diagram Venn na patuduhon godang ni protein mitokondria na ditanda di PN na digoari. (F) Plot gunung berapi protein na diekspresihon secara berbeda di saraf Mfn2cKO di 8 minggu (nilai potong signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas patuduhon lima jalur na rumingkot tu ginjang (merah) dohot tu toru (biru) di PN Mfn2cKO na digoari 8 minggu. Dipatuduhon do tingkat ekspresi rata-rata ni ganup protein na diida. Peta panas skala abu-abu: nilai P disesuaikan. ns, ndang ringkot.
Data proteomik patuduhon molo ekspresi protein kompleks I, III, dohot IV lam moru. Kompleks I, III, dohot IV sude marisi subunit na markode mtDNA na ringkot, sementara kompleks II, na holan markode inti, dasarna ndang hona (Gambar 2A dohot Gambar S2A). . Sadalan tu hasil proteomik, imunohistokimia bagian jaringan otak patuduhon na tingkat subunit kompleks IV di PN lam moru (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 na dikodehon mtDNA markurang do (Gambar S2A), sementara tingkat keadaan mantap subunit ATP sintase na dikodehon inti tetap ndang muba, na sadalan tu kompleks F1 subrakit sintase ATP na stabil na binoto molo ekspresi mtDNA stabil. Pembentukan na sadalan do. Mangganggu (7). Evaluasi tingkat mtDNA di PN Mfn2cKO na diurut marhite reaksi berantai polimerase waktu nyata (qPCR) memastikan penurunan bertahap jumlah salinan mtDNA. Molo dibandinghon tu kelompok kontrol, di umur 8 minggu, holan hira-hira 20% do tingkat mtDNA na dipertahanhon (Gambar 2C). Sadalan tu hasil on, pewarnaan mikroskop konfokal ni PN Mfn2cKO laho mangalului DNA patuduhon konsumsi nukleotida mitokondria na margantung tu tingki (Gambar 2D). Didapot hami do holan pigapiga calon na terlibat di degradasi protein mitokondria dohot tanggapan stres na diatur tu ginjang, tarmasuk ma i Lonp1, Afg3l2 dohot Clpx, dohot faktor perakitan kompleks OXPHOS. Ndang adong perubahan na signifikan di tingkat protein na terlibat di apoptosis (Gambar S2B). Songon i ma, dapot hami do molo mitokondria dohot saluran retikulum endoplasma na terlibat di pengangkutan kalsium holan adong do perubahan na gelleng (Gambar S2C). Asing ni i, evaluasi ni protein na marpardomuan tu autofagi ndang adong jumpang parubahan na signifikan, na sadalan tu induksi na tarida sian autofagosom na diida di vivo marhite imunohistokimia dohot mikroskopi elektron (Gambar S3). Alai, disfungsi OXPHOS na lam tu majuna di PN didongani perubahan mitokondria na jelas. Gugus mitokondria boi do idaon di badan sel dohot pohon dendritik ni PN Mfn2cKO na marumur 5 dohot 8 minggu, jala struktur selaput bagian dalam nunga mengalami perubahan na bagas (Gambar S4, A dohot B). Sadalan tu perubahan ultrastruktur on dohot penurunan mtDNA na signifikan, analisis irisan otak otak akut dohot ester metil tetrametilrodamin (TMRM) patuduhon na potensi selaput mitokondria di PN Mfn2cKO signifikan penurunan (Gambar S4C).
(A) Analisis pardalanan ni tingki tingkat ekspresi kompleks OXPHOS. Holan mangarimangi protein na mar-P<0,05 di 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis titik-titik: Ndang adong penyesuaian molo dibandingkon tu CTRL. (B) Hambirang: Contoh bagian otak na marlabel antibodi anti-MTCO1 (batang skala, 20 μm). Bidang na di inganan ni badan sel Purkinje ditutupi dohot warna kuning. Kanan: Kuantifikasi tingkat MTCO1 (analisis varians satu arah; n = 7 sahat tu 20 sel dianalisis sian tolu tikus). (C) Analisis qPCR nomor salinan mtDNA di PN na diurut (analisis varians satu arah; n = 3 sahat tu 7 tikus). (D) Hambirang: Contoh ni potongan otak na marlabel antibodi anti DNA (batang skala, 20 μm). Bidang na di inganan ni badan sel Purkinje ditutupi dohot warna kuning. Kanan: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians satu arah; n = 5 sahat tu 9 sel sian tolu tikus). (E) Contoh bagian otak akut na patuduhon sel mitoYFP + Purkinje (panah) di rekaman penjepit tambalan seluruh sel. (F) Pangukuran ni kurva IV. (G) Rekaman perwakilan suntikan arus depolarisasi di sel Purkinje CTRL dohot Mfn2cKO. Jejak atas: Pulsa pertama na memicu AP. Jejak bawah: Frekuensi AP maksimal. (H) Pangukuran ni masukan spontan pascasinaptik (sPS). Jejak rekaman perwakilan dohot rasio zoom na dipatuduhon di (I). Analisis varians satu arah dianalisis n = 5 sahat tu 20 sel sian tolu tikus. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 do i. (J) Jejak perwakilan AP spontan na dicatat mamangke mode penjepit tambal berlubang. Jejak atas: Frekuensi AP maksimal. Jejak bawah: zoom ni sada AP. (K) Mangukur rata-rata dohot maksimal frekuensi AP hombar tu (J). ujian ni si Mann; n = 5 sel dianalisis sian opat tikus. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM; ndang ringkot.
Kerusakan OXPHOS na jelas diida di PN Mfn2cKO na marumur 8 minggu, na patuduhon na fungsi fisiologis ni saraf mansai so normal. Alani i, dianalisis hami ma ciri-ciri listrik pasif ni neuron na hurang OXPHOS di 4 sahat tu 5 minggu dohot 7 sahat tu 8 minggu marhite na patupahon rekaman penjepit tambalan seluruh sel di irisan otak kecil akut (Gambar 2E). Ndang panagaman, rata-rata potensi membran istirahat dohot tahan masukan ni saraf Mfn2cKO sarupa do tu kontrol, nang pe adong perbedaan halus antar sel (Tabel 1). Songon i ma di umur 4 sahat tu 5 minggu, ndang adong jumpang perubahan na signifikan di hubungan arus-tegangan (kurva IV) (Gambar 2F). Alai, ndang adong saraf Mfn2cKO na marumur 7 sahat tu 8 minggu na martahan sian rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), na patuduhon adong kepekaan na jelas tu potensi hiperpolarisasi di tahap akhir on. Sebalikna, di saraf Mfn2cKO, arus depolarisasi na mambahen debit potensial aksi berulang (AP) denggan ditoleransi, na patuduhon pola debit nasida secara keseluruhan ndang marbeda situtu sian saraf kontrol na marumur 8 minggu (Tabel 1 dohot Gambar 2G). Songon i ma nang jotjot dohot amplitudo ni arus pascasinaptik spontan (sPSC) sarupa do tu kelompok kontrol, jala jotjot ni angka na masa lam tamba sian 4 minggu tu 5 minggu tu 7 minggu tu 8 minggu dohot tamba na sarupa (Gambar 2, H dohot I). Masa pendewasaan sinaptik di PN (25). Hasil na sarupa dapot dung tambalan PNs berlubang. Konfigurasi on mangambati kemungkinan kompensasi cacat ATP sel, songon na boi masa di rekaman penjepit tambalan seluruh sel. Secara khusus, potensi selaput istirahat dohot frekuensi penembakan spontan saraf Mfn2cKO ndang terpengaruh (Gambar 2, J dohot K). Singkatna, hasil on patuduhon molo PN na marfungsi OXPHOS na jelas boi mangadopi pola debit frekuensi tinggi dohot denggan, na patuduhon adong mekanisme kompensasi na mambahen nasida boi mampartahanhon tanggapan elektrofisiologis na jonok tu normal.
Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM (analisis varians satu arah, uji perbandingan berganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomor unit dipatudu marhite kurung.
1G) na tarmasuk jalur na boi mangalo kekurangan OXPHOS na parah, marhite i patoranghon boasa PN na hona boi mampartahanhon elektrofisiologi na hampir normal (Gambar 2, E sahat tu K). . Analisis proteomik patuduhon, enzim na tarlibat di katabolisme asam amino rantai bercabang (BCAA) secara signifikan diatur tu ginjang (Gambar 3A dohot Gambar S5A), jala produk akhir asetil-CoA (CoA) manang suksinil CoA boi melengkapi trikarboksilat di arteriosklerosis (TCA). Didapot hami do, lam tamba do kandungan ni transaminase 1 (BCAT1) dohot BCAT2. Nasida mangkatalisis langkah parjolo ni katabolisme BCAA marhite na manghasilhon glutamat sian α-ketoglutarat (26). Sude subunit na mambahen kompleks asam keto rantai bercabang (BCKD) diatur tu ginjang (kompleks i mangkatalisis dekarboksilasi na mangihut jala na so boi dibalik sian rangka karbon BCAA na dihasilhon) (Gambar 3A dohot Gambar S5A). Alai, ndang adong perubahan na jelas di BCAA i sandiri na dapot di PN na diurut, na boi ala ni tamba ni pengambilan sel ni asam amino esensial on manang pangkeon ni sumber na asing (glukosa manang asam laktat) laho melengkapi siklus TCA (Gambar S5B). PN na hurang OXPHOS pe patuduhon peningkatan penguraian dohot aktivitas transaminasi glutamin di umur 8 minggu, na boi tarida sian pengaturan naik ni enzim mitokondria glutaminase (GLS) dohot glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A dohot C). Siparrohahonon do, pengaturan naik ni GLS terbatas tu isoform glutaminase C (GLS-GAC) na disambung (perubahan Mfn2cKO/CTRL hira-hira 4,5 hali lipat, P = 0,05), jala pengaturan naik na khusus di jaringan kanker Boi mendukung mitokondria. (27).
(A) Peta panas patuduhon perubahan lipatan tingkat protein tu rute na ditontuhon di 8 minggu. (B) Contoh irisan otak na marlabel antibodi anti-PCx (batang skala, 20 μm). Panah na marwarna kuning patuduhon tu badan sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein pardalanan ni tingki ditanda songon calon na ringkot tu aterosklerosis (uji t marganda, * FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) Di ginjang: Gambar skematik na patuduhon cara na marasing laho masuk tu karbon na marlabel na adong di [1-13C] penjejak piruvat (i ma, marhite PDH manang jalur trans-arteri). Di toru: Bagan biola patuduhon persentase karbon na marlabel tunggal (M1) na diuba gabe asam aspartat, asam sitrat dohot asam malat dung dicap irisan otak otak akut dohot [1-13C]piruvat (uji t berpasangan; ** P <0,01). (E) Analisis sejarah waktu na lengkap taringot tu dalan na dipatuduhon. Holan mangarajumi protein na mar-P<0,05 di 8 minggu . Garis putus-putus: ndang adong nilai penyesuaian (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM.
Di analisis nami, katabolisme BCAA nunga gabe salah sada jalur kunci tu ginjang. Fakta on mansai patuduhon na boi do muba volume ventilasi na masuk tu siklus TCA di PN na hurang OXPHOS. Hal on bisa manggombarkon bentuk godang tingon kabel ulang metabolisme saraf, na bisa mardampak langsung tu fisiologi saraf dot kalangsungan hidup i maso pameliharaan disfungsi OXPHOS na parah. 3A), na mangkatalisis konversi piruvat gabe oksaloasetat (28), na dihaporseai adong di otak, 30). Sadalan tu hasil proteomik, mikroskopi konfokal patuduhon ekspresi PCx secara khusus jala signifikan meningkat di PN na hurang OXPHOS, sementara reaktivitas PCx terutama dibatasi tu sel glial Bergmann na berdekatan sian kontrol (Gambar 3B). Laho manguji secara fungsional pengaturan PCx na diida, hami mangubati irisan otak akut dohot [1-13C] penjejak piruvat. Molo piruvat dioksidasi marhite piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopna mago , Alai dipamasuk tu perantara siklus TCA molo piruvat dimetabolisme marhite reaksi pembuluh darah (Gambar 3D). Di na mendukung data proteomik nami, diida hami do godang penanda sian penjejak on di asam aspartat ni irisan Mfn2cKO, sementara asam sitrat dohot asam malat pe adong do kecenderungan na sedang, nang pe ndang signifikan (Gambar 3D).
Di angka tikus MitoPark na marsahit disfungsi mitokondria na dibahen neuron dopamin na khusus mangagohon gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx pe signifikan do diatur tu ginjang (31), na patuduhon na asam aseton na mambahen disfungsi arteriosklerosis ni OKSFOS di pamatang. Siparrohahonon do, nunga didapot enzim na unik (32-34) na boi dipatuduhon di saraf na boi marpardomuan tu arteriosklerosis, na marlapatan do i diatur tu ginjang di PN na hurang OXPHOS, isara ni propionil-CoA karboksilase (PCC-A), enzim 3 (ME3), na peran utamana laho mambuat piruvat sian malat (Gambar 3, A dan C) (33, 35). Asing ni i, dapot hami do peningkatan na signifikan di enzim Pdk3, na fosforilasi jala marhite i mambahen PDH ndang aktif (36), sementara ndang adong perubahan na diida di enzim Pdp1 na mangaktifhon PDH manang kompleks enzim PDH i sandiri (Gambar 3A). Didok ibana, “Diboto mangambati aktivitas enzim ni PDH di Ser293 (diboto mangambati aktivitas enzim ni PDH). Piruvat ndang adong akses pembuluh darah.
Na parpudi, dapot hami ma jalur super biosintesis serin dohot glisin, siklus mitokondria folat (1C) na marpardomuan dohot biosintesis prolin (Gambar 1G dohot Gambar S5C) sude signifikan diatur tu ginjang, mangihuthon laporan, saleleng proses aktivasi. Jaringan na humaliang diaktifhon dohot disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal na mendukung data proteomik on patuduhon molo di PN na hurang OXPHOS, irisan otak tikus na marumur 8 minggu dibahen tu serin hidroksimetiltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci siklus folat mitokondria. Tanggapan kekebalan tubuh na signifikan (Gambar S5D). Di 13 irisan otak akut na diinkubasi CU-glukosa, percobaan pelacakan metabolisme lam patoguhon pengaturan naik ni biosintesis serin dohot prolin, na patuduhon na lam tamba do fluks ni isoform karbon gabe serin dohot prolin (Gambar S5E). Ala reaksi na dipromosihon GLS dohot GPT2 martanggung jawab tu sintesis glutamat sian glutamin dohot transaminasi antara glutamat dohot α-ketoglutarat, upregulasi nasida patuduhon na neuron na hurang OXPHOS adong peningkatan permintaan tu glutamat . I balik ni parubahan on, analisis proteomik astrosit otak sian tikus Mfn2cKO spesifik PN patuduhon molo jalur on (termasuk sude antiperoksidase) ndang marhamubaon na signifikan di ekspresi, gabe patuduhon pengalihan metabolisme on selektif tu PN na terdegradasi (Gambar S6, G).
Singkatna, analisis on mangungkaphon pola na marasing situtu sian aktivasi temporal ni jalur metabolisme tertentu di PN. Nang pe fungsi mitokondria saraf na so normal boi mambahen aterosklerosis dini dohot pemodelan 1C (Gambar 3E dohot Gambar S5C), jala bahkan perubahan ekspresi kompleks I dohot IV na boi diprediksi, perubahan sintesis serin de novo holan Holan tarida do i di stage akhir. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E dohot Gambar S5C). Hatorangan on manontuhon proses na marurutan di na mitokondria (siklus 1C) dohot sitoplasma (biosintesis serin) na dibahen stres marsinergis dohot tamba ni aterosklerosis di siklus TCA laho mambahen ulang metabolisme saraf.
PN na hurang OXPHOS na marumur 8 minggu boi mampartahanhon aktivitas eksitasi frekuensi na timbo jala mangalami rekoneksi metabolisme na signifikan laho manggantihon disfungsi mitokondria. Penemuan on mambaen kemungkinan na menarik molo sanga i saat on, sel-sel on juo bisa Manjalo campur tangan terapi giot manunda sanga mangambati degenerasi saraf. Tarlambat. Diselesaikan hami do kemungkinan on marhite dua campur tangan na mandiri. Di metode na parjolo, hami merancang vektor virus na mardomu tu adeno (AAV) na margantung tu Cre asa boi MFN2 diekspresihon secara selektif di PN na hurang OXPHOS di bagasan ngolu (Gambar S7A). AAV na mangkode MFN2 dohot gen reporter neon mCherry (Mfn2-AAV) diverifikasi di kultur neuron primer di vitro, na mambahen MFN2 diekspresihon marhite cara na margantung tu Cre jala paluahon morfologi mitokondria, marhite i mangambati neuromutasi di Mfns. Dung i, dibahen hami ma percobaan di vivo laho pasahathon Mfn2-AAV na marumur 8 minggu tu korteks otak ni Mfn2cKO dohot tikus kontrol, jala dianalisis tikus na marumur 12 minggu (Gambar 4A). Tikus Mfn2cKO na dirawat mate (Gambar 1, A dan B) (16). Transduksi virus di vivo manghorhon ekspresi selektif PN di pigapiga lingkaran otak (Gambar S7, G dohot H). Suntikan AAV kontrol na menyatakan holan mCerry (Ctrl-AAV) ndang adong pengaruh na signifikan tu tingkat degenerasi saraf di binatang Mfn2cKO. Sebalikna, analisis Mfn2cKO na ditransduksi dohot Mfn2-AAV patuduhon efek perlindungan na signifikan sian lapisan sel PN (Gambar 4, B dohot C). Secara khusus, hira na so boi do dibedahon kepadatan saraf sian binatang kontrol (Gambar 4, B dohot C, dohot Gambar S7, H dohot I). Ekspresi MFN1 alai ndang MFN2 dos do efektifna laho paluahon hamatean ni saraf (Gambar 4C dohot Gambar S7, C dohot F), na patuduhon na ekspresi MFN1 ektopik boi efektif melengkapi hahurangan ni MFN2. Analisis selanjutna i tingkat PN tunggal patuduhon molo Mfn2-AAV godang paluahon ultrastruktur mitokondria, normalisasi tingkat mtDNA, jala mambalikkon ekspresi na timbo sian penanda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C sahat tu E ). Pemeriksaan visual tu tikus Mfn2cKO na dipalua di keadaan istirahat patuduhon na lam denggan do postur dohot gejala motorik (gerakan S1 sahat tu S3). I bagasan kesimpulan, parcubaan on patuduhon molo tartunda pamasukhon muse MFN2 tu PN na parah hurang OXPHOS cukup laho mambalikkon konsumsi mtDNA dohot manginduksi aterosklerosis, marhite i mangambati degenerasi akson dohot hamatean saraf di vivo.
(A) Skema na patuduhon jadwal percobaan laho manyuntik AAV na mangkodehon MFN2 tingki diaktifhon jalur metabolisme na dipatuduhon. (B) Foto konfokal perwakilan bagian otak otak na marumur 12 minggu na ditransduksi dohot tikus Mfn2cKO di 8 minggu jala dicap dohot antibodi anti-Calbindin. Kanan: Skala ni serat akson. Skala ni zoom akson ima 450 dohot 75 μm. (C) Kiri: Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje di lingkaran transduksi AAV (AAV +) (analisis varians satu arah; n = 3 tikus). Kanan: analisis fokus mtDNA di PN na ditransduksi di minggu 12 (uji t na so marpasangan; n = 6 sel sian tolu tikus). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mikrograf elektron transmisi perwakilan PN bagian otak Mfn2cKO na ditransduksi dohot vektor virus na dipatuduhon. Topeng na marwarna pink manggombarhon luat na di inganan ni dendrit, jala kotak na martitik-titik na marwarna kuning manggombarhon zoom na diparade di siamun; n manggombarhon inti. Batang skala, 1 m. (E) patuduhon contoh pewarnaan PCx di PN na ditransduksi di 12 minggu. Batang skala, 20 μm. OE, ekspresi na marlobi-lobi; FC, lipat ganti.
Na parpudi, hami manungkun ringkot ni kelangsungan hidup sel na dibahen peroksidase di PN na hea mangalami disfungsi OXPHOS. Dibahen hami ma mCherry na mangkodehon AAV-shRNA (RNA jepit rambut pendek) na khusus ditujuhon tu mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), jala disuntik hami ma virus manang kontrol na dibahen (AAV-scr) tu otak ni tikus Mfn2cKO. Suntikan i diulahon di minggu umur paopathon (Gambar 5A) laho mandapot knockdown PCx na efektif di periode ekspresi PCx meningkat (Gambar 3C) jala lapisan sel PN utuh dope (Gambar 1A). Siparrohahonon do, molo dipatunduk PCx (Gambar S8A) gabe lam tu percepatan ni hamatean ni PN, i ma sada-sadana cincin infeksi na terbatas (Gambar 5, B dohot C). Dibahen ma mangantusi mekanisme ni panghorhon ni metabolisme na dibahen PCx tu ginjang, diparsiajari hami ma status redoks ni PN dung digulinghon PCx jala dipatuduhon ma secara serentak. Dung i, diulahon hami ma mikroskopi pencitraan seumur hidup (FLIM) dua foton di irisan otak akut ni Mfn2cKO na marumur 7 minggu manang dongan saripe na mangatur laho mangalului perubahan na boi masa di status redoks sitoplasma dung diverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E sahat tu G). Analisis i patuduhon peningkatan na signifikan di keadaan oksidasi ni sada PN Mfn2cKO na hurang ekspresi PCx, na marasing sian neuron kontrol manang PN Mfn2cKO na holan mengekspresihon shRNA na diacak (Gambar 5, D dohot E). Di tingki ekspresi PCx diatur tu toru, persentase PN Mfn2cKO na patuduhon keadaan na mansai teroksidasi meningkat lobi sian tolu hali (Gambar 5E), na patuduhon na pengaturan tu ginjang PCx mampartahanhon kapasitas redoks ni neuron na buruk.
(A) Skema na patuduhon jadwal percobaan laho manyuntik AAV na mangkodehon shPCx tingki diaktifhon jalur metabolisme na dipatuduhon. (B) Foto konfokal perwakilan bagian otak na marumur 8 minggu di tikus Mfn2cKO na ditransduksi jala dicap dohot antibodi anti-kalsineurin di 4 minggu. Batang skala, 450 μm. (C) Pangukuran kepadatan sel Purkinje di lingkaran na ditransduksi AAV (analisis varians satu arah; n = 3 sahat tu 4 tikus). Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM; ***P<0,001 do i. (D) Gambar FLIM perwakilan patuduhon rata-rata umur ni PN na marumur 7 minggu na menyatakan sensor redoks glutation Grx1-roGFP2 di kondisi percobaan na ditontuhon. Rasio LUT (tabel pencarian): selang waktu kelangsungan hidup (di bagasan pikodetik). Batang skala, 25 μm. 158 sahat tu 368 sel di dua tikus di ganup kondisi). Bagan pie di ginjang ni ganup histogram: patuduhon godang ni sel na marnilai umur na ganjang (merah, teroksidasi) manang jempek (biru, berkurang), na lobi sian 1 SD sian nilai umur rata-rata di CTRL-AAV-scr. (F) Model na diusulhon patuduhon efek perlindungan ni pengaturan PCx saraf.
Sude di sude, data na hupasahat hami dison patuduhon na ekspresi ulang ni MFN2 boi hibul paluahon PN na maju dohot kekurangan OXPHOS na parah, hahurangan mtDNA na parah, dohot morfologi na songon ista na mansai so normal, marhite i mangalehon hamajuon na torus nang pe di sahit na maju. Degenerasi saraf mangalehen bukti na bisa ibalik tingon tahap i jolo hamatean sel. Tingkat fleksibilitas metabolisme on lobi diondolhon marhite kemampuan ni neuron laho manginduksi aterosklerosis (kabel ulang siklus TCA), na mangambati ekspresi PCx di PN na hurang OXPHOS jala pagandahon hamatean ni sel, marhite i marperan mangalinggomi (Gambar 5F).
Di penelitian on, hami mangalehon bukti molo tanggapan ni PN tu disfungsi OXPHOS ima martahap mardomu tu aterosklerosis siklus TCA marhite jalur aktivasi diferensial na diaktifhon program metabolisme. Dipatogu hami do analisis proteomik marhite godang metode na saling melengkapi jala dipapatar hami do molo ditantang disfungsi mitokondria na parah, saraf adong bentuk elastisitas metabolisme na so binoto hian. Na mambahen longang rohanta, sude proses pengambilan ulang ndang pola mananda keadaan metabolisme ujung na mandongani degenerasi saraf secara bertahap jala ndang boi muba, alai datanta mandok na boi do i gabe saraf pemeliharaan nang pe di tahap andorang so mate sel Mekanisme kompensasi fungsional. Hatorangan on patuduhon molo saraf adong tingkat plastisitas metabolisme na mansai balga di pamatang. Fakta on mambuktihon molo parmasukhon muse MFN2 di pudian ni ari boi mambalikkon ekspresi ni penanda metabolisme kunci jala mangambati degenerasi PN. Sabalikna, i do na mangambati aterosklerosis jala mambahen lam hatop saraf. margabus.
Sada sian na dapot na paling menarik di penelitian nami ima PN na hurang OXPHOS boi manguba metabolisme siklus TCA marhite enzim na mangatur tu ginjang na khusus merangsang arteriosklerosis. Penataan ulang metabolisme ima sada fitur umum sel kanker, sabagian sian i mangasahon glutamin laho manambai perantara siklus TCA laho manghasilhon setara pangurangan, na manogunogu rantai pernapasan dohot mampartahanhon produksi lipid dohot nukleotida prekursor biosintesis (39 , 40). Sada penelitian na baru-baru on patuduhon, di jaringan tepi na mangalami disfungsi OXPHOS, sambungan ulang ni metabolisme glutamin/glutamat pe gabe fitur na menonjol (5, 41), di na arah masuk ni glutamin tu siklus TCA margantung tu Ala parah ni luka OXPHOS (41). ). Tai, inda adong bukti na jelas taringot tu sarupa plastisitas metabolisme saraf i pamatang dot kemungkinan relevansina i konteks sahit. Di sada penelitian na baru-baru on, saraf kortikal primer dipatuduhon laho manggerakkon kolam glutamat laho transmisi saraf, marhite i mambahen tubu metabolisme oksidatif dohot aterosklerosis di bagasan kondisi stres metabolisme (42). Siparrohahonon do, di toru ni penghambatan farmakologis ni enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat dihaporseai laho mampartahanhon sintesis oksaloasetat di neuron butiran otak na dibudidayahon (34). Alai, relevansi fisiologis ni mekanisme on tu jaringan otak (di dia aterosklerosis dihaporseai tarlumobi terbatas tu astrosit) tong do adong makna fisiologis na ringkot (43). Di bagasan on, data nami patuduhon molo PN na sega alani OXPHOS di pamatang boi beralih tu degradasi BCAA dohot karboksilasi piruvat, na gabe dua sumber utama suplemen perantara kolam TCA. Anggo kontribusi na ianggap tingon katabolisme BCAA tu metabolisme energi saraf madung iusulkon, salain peran glutamat dot GABA tu transmisi saraf (44), inda adong dope bukti tu mekanisme on i vivo. Alani i, mura do marsangka molo PN na so marfungsi boi otomatis manggantihon konsumsi perantara TCA na didongani proses asimilasi marhite na manambai aterosklerosis. Secara khusus, pengaturan PCx mungkin dihaporluhon laho mempertahankan permintaan asam aspartat na lam tamba, na nunga dipatuduhon di sel na martambatamba dohot disfungsi mitokondria (45). Alai, analisis metabolomik nami ndang pataridahon perubahan na signifikan di tingkat keadaan mantap asam aspartat di PN Mfn2cKO (Gambar S6A), na dianggap mencerminkan pemanfaatan metabolisme na marasing sian asam aspartat antara sel na martambatamba dohot saraf pasca-mitosis . Nang pe mekanisme na tepat ni pengaturan PCx di saraf na so marfungsi di vivo tongtong dope ingkon ditanda, hami patuduhon na tanggapan dini on marperan na ringkot laho mampartahanhon keadaan redoks ni saraf, na dipatuduhon di percobaan FLIM di irisan otak. Secara khusus, mangambati PNs tingon PCx na mangatur tu ginjang bisa mambaen keadaan na lobi teroksidasi dot mamparcepat hamatean sel. Aktivasi degradasi BCAA dohot karboksilasi piruvat ndang cara laho mancirihon jaringan tepi disfungsi mitokondria (7). Alani i, hira na gabe fitur prioritas ni saraf na hurang OXPHOS do nasida, nang pe ndang holan fitur i, na ringkot tu degenerasi saraf. .
Sahit otak kecil ima jenis sahit saraf na heterogen na somalna tarida songon ataksia jala jotjot manegai PN (46). Populasi saraf on tarlumobi rentan tu disfungsi mitokondria harana degenerasi selektif ni alai i tikus cukup mambaen bahat gejala motorik na mantanda ataksia otak tulang rusuk ni jolma (16, 47, 48). Mangihuthon laporan, model tikus transgenik dohot gen mutan marpardomuan tu ataksia otak tulang belakang ni jolma jala adong disfungsi mitokondria (49, 50), na mangondolhon ringkot ni mamparsiajari konsekuensi ni defisiensi OXPHOS di PNPH. Alani i, mansai cocok do i laho mangisolasi dohot mamparsiajari populasi saraf na unik on. Tai, harana PN sangat sensitif tu tekanan dot mambaen bagian na rendah tingon sude populasi sel otak, tu bahat studi na marbasis omik, pamisahan selektif tingon alai manjadi sel utuh totop manjadi aspek na manantang. Nang pe hampir ndang mungkin dapot hurang mutlak ni pencemaran jenis sel na asing (tarlumobi jaringan dewasa), hami padomuhon langkah disosiasi na efektif dohot FACS laho mandapot jumlah neuron na cukup layak untuk analisis proteomik hilir, jala adong cakupan protein na cukup tinggi (hira-hira 3000) (51). Marhite na mangaramoti kelangsungan hidup ni saluhut sel, metode na huparade hami dison mambahen hami ndang holan mamareso parubahan ni jalur metabolisme di mitokondria, alai dohot do mamareso parubahan ni rekan-rekan sitoplasma na, na melengkapi pangkeon ni pengayaan label selaput mitokondria na khusus tu angka sel mitokondria na baru. (52, 53). Metode na itagombarhon on ndang hum marpardomuan tu parsiajaran sel Purkinje, alai boi do mura-mura dipangke tu jenis sel aha pe laho mangadopi parubahan metabolisme di otak na marsahit, tarmasuk model disfungsi mitokondria na asing.
Na parpudi, nunga tatanda jendela terapi saleleng proses penataan ulang metabolisme on na boi sasintongna mambalikkon tanda-tanda kunci ni stres sel jala mangambati degenerasi saraf. Alani i, mangantusi implikasi fungsional ni kabel ulang na digombarhon dison boi mangalehon wawasan mendasar taringot tu kemungkinan parubatan laho mampartahanhon kelangsungan hidup saraf saleleng disfungsi mitokondria. Penelitian tu maso nangkan ro na martujuan tu mambedah parubahan metabolisme energi i jenis sel otak lainna porlu tu lengkap mangungkapkon kelayakan prinsip on tu sahit saraf lainna.
Tikus MitoPark nunga digombarhon di jolo (31). Tikus C57BL/6N na margen Mfn2 na mangapit loxP nunga digombarhon najolo (18) jala disilanghon dohot tikus L7-Cre (23). Keturunan heterozigot ganda na dihasilhon i, disilanghon ma dohot tikus homozigot laho manghasilhon knockout gen spesifik Purkinje tu Mfn2 (L7-cre). Di sada himpunan bagian ni parkawinan, dibahen ma alel Gt (ROSA26) marhite silang tambahan (20). Sude prosedur binatang diulahon hombar tu pedoman Eropa, nasional dohot lembaga jala ditolopi LandesamtfürNatur sian Umwelt dohot Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westfalia, Jerman. Ulaon binatang pe mangihuthon panogunoguon ni Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium Federasi Eropa.
Dung dibius dislokasi serviks ni ina na marhamulian, diisolasi ma embrio tikus (E13). Korteks dibedah di bagasan Larutan Garam Seimbang Hanks (HBSS) na ditambahi dohot Hepes 10 mM jala dipasahat tu Media Elang Modifikasi Dulbecco na marisi papain (20 U/ml) dohot sistein (1μg/ml). Inkubasi ma jaringan i di DMEM) jala disosiasihon ma i marhite pencernaan enzimatik. Ml) di suhu 37°C saleleng 20 menit, dung i digiling secara mekanis di DMEM na ditambahi dohot serum sapi janin 10%. Sel diboan di penutup kaca na dilapisi polilisin di kepadatan 2 × 106 per piring kultur 6 cm manang di kepadatan 0,5 × 105 sel / cm2 laho analisis pencitraan. Dung 4 jom, media i diganti dohot media bebas serum Neurobasal na mengandung suplemen B27 1% dohot GlutaMax 0,5 mM. Dung i, neuron i dijaga di suhu 37°C dohot 5% CO2 saleleng parcubaan, jala dilehon mangan sahali saminggu. Dibahen ma 3 μl (piring kultur 24 sumur) manang 0,5 μl (piring 24 sumur) sian vektor virus AAV9 na mangihut on laho mangubati neuron di ari paduahon di bagasan vitro: AAV9. 105530-AAV9) dohot AAV9.
DNA pelengkap Mfn1 dohot Mfn2 tikus (na dapot sian plasmid Addgene # 23212 dohot # 23213, masing-masing) ditandai dohot urutan V5 (GKPIPNPLLGLDST) di ujung C, jala dipasada dohot mCherry di bingkai marhite urutan T2A. Grx1-roGFP2 ima hadiah sian Heidelberg TP Dick DFKZ. Marhite na mangganti kaset tdTomat mamangke cara kloning konvensional, kaset i disubkloning tu tulang punggung pAAV-CAG-FLEX-tdTomat (nomor acuan Addgene 28306) laho manghasilhon pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, p Vektor fleksi-mceri-t2a-mfn1-v5 dohot vektor pav-cag-fleksi-grx-rogfp2. Dipangke do strategi na sarupa laho mambahen vektor kontrol. Laho mambahen konstruksi AAV-shPCx, dihaporluhon do vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA # 1]), na marisi urutan DNA na mangkode shRNA PCx tikus na dituju 3′) Di toru ni kendali ni promotor U6, mCherry dipangke di toru ni kendali ni promotor CMV. Produksi vektor AAV bantu diulahon hombar tu tudutudu ni pabrik (Biolabs Sel). Singkatna, pangke ma plasmid transfer na mamboan mCherry-T2A-MFN2-V5, secara sementara 10:10, 11. 10 I, songon i nang pengkodean protein kapsid AAV1 dohot protein aksesoris Plasmid plasmid kemasan, mamangke metode kalsium fosfat. Supernatan virus kasar didapot marhite siklus beku-cair di mandi es/etanol kering jala dilisis sel di garam penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV dimurnikan dengan ultrasentrifugasi gradien yodiksanol na so berkelanjutan (24 jam di 32.000 rpm dohot 4°C) jala dikonsentrasihon mamangke saringan ultra-15 Amicon. 2,9 × 1013 salinan genom (GC)/ml, 6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX diukur secara kuantatif (waktu nyata) (1,9 x 1013 GC/ml) dohot 8,9 × 1012 GC/ml).
Neuron primer dikikis di PBS 1x na ngali songon es, dipelet, dung i dihomogenhon di penyangga lisis natrium deoksikolat 0,5% na mengandung fosfatase dohot penghambat protease (Roche). Dibahen ma pangukuran ni protein marhite na mamangke uji asam bisinkoninat (ilmiah termo nelayan). Protein-protein i dungni ipisahkon dohot elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, dungi i-blot tu membran polivinilidenfluorida (GE Healthcare). Diblokir ma inganan na so spesifik jala diinkubasi ma dohot antibodi primer (ida Tabel S1 asa lam tangkas) di susu 5% di TBST (garam penyangga Tris dohot Tween), langkah-langkah pencucian dohot antibodi sekunder di Inkubasi TBST. Dibahen ma antibodi primer saborngin di suhu +4°C. Dung dicuci, dibahen ma antibodi sekunder saleleng 2 jom di suhu kamar. Dung i, marhite na mangikubasi blot na sarupa dohot antibodi anti-β-aktin, diparhatopot ma beban na sarupa. Deteksi marhite na manguba gabe kimia pecahaya dohot meningkatkan kimia pecahaya (GE Kesehatan).
Neuron na jolo diboan di penutup kaca diperbaiki dohot 4% paraformaldehida (PFA) / PBS di titik waktu na ditontuhon di suhu kamar saleleng 10 menit. 100/PBS 0,1% saleleng 5 menit di suhu kamar, dung i di penyangga penghambat [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Di ari paduahon, dicuci ma angka tutup i dohot penyangga penghalang jala diinkubasi dohot antibodi sekunder na hombar dikonjugasi fluorofor saleleng 2 jom di suhu kamar; akhirna, sampel dicuci secara menyeluruh di PBS dengan 4 ',6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) diwarnai dan kemudian diperbaiki di slide mikroskop dengan Aqua-Poly / Gunung.
Tikus (jantan dohot borua) dibius marhite suntikan ketamin (130 mg/kg) dohot xilazin (10 mg/kg) tu bagasan kulit jala dibahen tu toru ni kulit dohot obat penghilang rasa sakit karprofen (5 mg/kg) , Jala dibahen tu alat stereotaktik (Kopd a warmf) dohot alat panas. Patandahon tangkorak jala mamangke bor gigi laho manipishon bagian korteks otak na hombar tu tulang mis (sian lambda: ihur 1,8, lateral 1, hombar tu lobus IV dohot V). Pake ma jarum jarum suntik na melengkung asa manat mambahen lubang na gelleng di tangkorak asa unang ganggu pembuluh darah na di toru. Dung i, kapiler kaca na ditarik tipis i dipamasuk ma lambat-lambat tu lubang mikro (sian -1,3 sahat tu -1 di sisi ventral ni dura mater), jala 200 sahat tu 300 nl AAV disuntikhon tu mikro-injektor (Narishige) dohot jarum suntik manual (narishige) di periode tekanan waktu sever100. menit jendela. Dung di infus, lehon ma kapiler i saleleng 10 menit nai asa boi virus i merambat sandok. Dung dibuat kapiler i, dijahit ma kulitna denggan asa unang radang luka i jala boi malum binatang i. Dirawat ma angka binatang i dohot obat penghilang rasa sakit (kaspofen) saleleng pigapiga ari dung operasi, di tingki i dipamanat do kondisi fisikna dohot denggan dung i dieutanasi ma nasida di titik waktu na disurathon. Sude prosedur diulahon hombar tu pedoman Eropa, nasional dohot lembaga jala ditolopi LandesamtfürNatur sian Umwelt dohot Verbraherschutz, Rhina Utara-Westfalia, Jerman.
Dibius ma binatang i dohot ketamin (100 mg/kg) dohot xilazin (10 mg/kg), jala jantung i diperfusi dohot PBS 0,1 M parjolo, dung i PFA 4% di PBS. Jaringan i dibedah jala diperbaiki di PFA/PBS 4% saborngin di suhu 4°C. Piso na margetar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) dipangke laho paradehon bagian sagital (ketebalan 50 μm) sian otak na hot di PBS. Molo so adong na asing, pewarnaan bagian-bagian na mangambang bebas diulahon songon na digombarhon di ginjang (13) di suhu kamar jala diaduk. Singkatna, parjolo, irisan na dapot i dipermeabilisasi dohot Triton X-100/PBS 0,5% saleleng 15 menit di suhu kamar; Molo adong epitope (Pcx dohot Shmt2), marhite di penyangga tris-EDTA di suhu 80°C (PH 9) pamanashon irisan i saleleng 25 menit manggantihon langkah on. Dung i, bagian-bagian i diinkubasi dohot antibodi primer (ida Tabel S1) di penyangga penghalang (3% BSA/PBS) di suhu 4°C saborngin huhut diaduk. Marsogotna i, dicuci ma bagian-bagian i dohot penyangga penghalang jala diinkubasi dohot antibodi sekunder na hombar dikonjugasi fluorofor saleleng 2 jom di suhu kamar; akhirna, bagian-bagian i dicuci dohot denggan di PBS, diwarnai DAPI, dung i diperbaiki dohot AquaPolymount Di slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X atau Lembar Cahaya Digital TCS, Mikrosistem Leica) na dilengkapi dohot laser cahaya na bontar dohot laser ultraviolet 405 dioda dipangke laho manggombarhon sampel i. Marhite na manghiburhon fluorofor dohot papunguhon sinyal dohot Detektor Hibrida (HyDs), perangkat lunak LAS-X dipangke laho papunguhon gambar na martumpu na hombar tu pengambilan sampel Nyquist di bagasan mode urutan: untuk panel non-kuantitatif, sinyal na mansai dinamis (misalna, di sel somatik dohot dendrit) ModeR na terang). Dibahen ma gerbang 0,3 sahat tu 6 ns laho mangurangi latar belakang.
Pencitraan waktu nyata ni sel na diurut. Dung dipillit di media Neurobasal-A na marisi suplemen B27 1% dohot GlutaMax 0,5 mM, pintor diboan ma sel-sel i tu slide kaca na dilapisi poli-l-lisin (μ-Slide8 Sumur, Ibidi, nomor katalog 80826) , Jala dung i dijaga ma i di suhu 1% tu CO2. laho menetap. Pencitraan waktu nyata dilakukan di mikroskop konfokal pemindaian laser Leica SP8 na dilengkapi dohot lensa objektif minyak laser na bontar, HyD, 63×[1,4 bukaan angka (NA)] dohot panggung pemanasan.
Tikus i hatop dibius dohot karbon dioksida jala diponggol, otakna hatop dibuat sian tangkorak, jala dipotong gabe 200μm tebal (tu percobaan pelabelan Fi3C) manang 275μm tebal (tu dua percobaan foton) bagian sagital na diisi dohot bahan-bahan crece berikut. 125 mM es dingin, jenuh karbon (95% O2 dan 5% CO2) rendah Ca2 + cairan otak buatan (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrium phos2, 1,25 mM natrium pho2. glukosa, Cacl2 0,5 mM dohot Cl2 3,5 mM (tekanan osmotik 310 sahat tu 330 mmol). Pindahon ma irisan otak na dapot tu ruang pra-inkubasi na marisi Ca2 + ACSF na tumimbo (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM Ca2. MgCl2) Sedang) pH 7,4 dohot 310 sahat tu 320 mmol).
Di tingki proses pencitraan, irisan i dipindahon tu ruang pencitraan na khusus, jala percobaan i diulahon di toru ni perfusi ACSF na torus-menerus di suhu na tetap 32° sahat tu 33°C. Mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) na dilengkapi dohot lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, aek), laser Ti: Safir (Bunglon Visi II, Koheren) dipangke laho pencitraan irisan. Modul FLIM (PikoHarp300, PikoKuant).
FLIM ni Grx1-roGfp2. Parubahan keadaan redoks sitoplasma PN diukur marhite FLIM dua foton di irisan otak sagital, di dia biosensor Grx1-roGFP2 ditujuhon tu PN. Di lapisan PN, bidang akuisisi dipillit hira-hira 50 sahat tu 80 μm di toru ni parmukaan ni irisan laho mamastihon adong PN na layak (i ​​ma, hurang ni struktur manik-manik manang perubahan morfologi saraf di sepanjang dendrit) dohot sensor roGFP2 positif ganda dohot pengkodean AAV mSakura). Papunguhon gambar tumpukan tunggal dohot perbesaran digital 2x [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: HyD internal, kelompok saringan isotiosianat fluoresen] dohot rata-rata gambar di bagasan 2 sahat tu 3 menit dipangke laho mamastihon na tuk do foton na dipapungu (1000 foton sude) laho pas kurva. mM H2O2 eksogen tu perfusi ACSF (laho mamaksimalhon deoksidasi, na manghorhon tu peningkatan umur ni pangurangan, manghorhon tu pangurangan ni umur) (Gambar S8, D sahat tu G). Dipake ma perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 laho manganalisis hasil na dapot, pas ma kurva peluruhan eksponensial tunggal ni sude gambar tu IRF na diukur (fungsi tanggapan alat), jala χ2 hira-hira 1. dipangke laho mangukur.
Analisa potensi mitokondria. Dung bagian akut diinkubasi dohot TMRM 100 nM langsung ditambahkan tu ACSF na diperfusi saleleng 30 menit, perubahan potensial mitokondria ni PN diukur marhite mikroskop dua foton. Pencitraan TMRM dilakukan dengan menghibur sonda di 920 nm dan mamakke HyD internal (tetrametilrodamin isotiosianat: 585/40 nm) laho papunguhon sinyal; marhite na mamangke panjang gelombang eksitasi na sarupa alai mamangke HyD internal na marasing (FITC :525/50) laho manggombarhon mtYFP. Pake ma plug-in Kalkulator Gambar ImageJ laho menilai potensi mitokondria di tingkat sel tunggal. Singkatna, persamaan colokan: sinyal = min (mtYFP, TMRM) dipangke laho mananda daerah mitokondria na patuduhon sinyal TMRM di Purkinje Somali di gambar konfokal tumpukan tunggal saluran na hombar. Dung i luas piksel di topeng na dihasilhon diukur, dung i dinormalisasi di gambar tumpukan tunggal ambang batas na hombar sian saluran mtYFP laho mandapot fraksi mitokondria na patuduhon potensi mitokondria.
Gambar i dibahen marhite perangkat lunak Huygens Pro (Pencitraan Volume Ilmiah). Molo gambar ni ubin na dipinda, montase ni sada ubin dibahen mamangke algoritma jahitan otomatis na diparade perangkat lunak LAS-X. Dung dikalibrasi gambar, pangke ma ImageJ dohot Adobe Photoshop laho mangolah gambar i jala seragam menyesuaihon cahaya dohot kontrasna. Pangke ma alat gambar adobe laho mambahen grafis.
Analisa fokus mtDNA. Jumlah lesi mtDNA diukur di bagian otak na dicap dohot antibodi tu DNA marhite mikroskop konfokal. Ganup luat sasaran dibahen tu badan sel dohot inti ni ganup sel, jala luat masing-masing dietong mamangke plug-in Multi Ukuran (perangkat lunak ImageJ). Kurangi luas inti sian luas badan sel asa dapot luas sitoplasma. Na parpudi, dipangke ma plug-in Analisa Partikel (perangkat lunak ImageJ) laho mangukur titik DNA sitoplasma na patuduhon mtDNA di gambar ambang batas, jala hasil na dapot dinormalisasi tu rata-rata PN ni tikus CTRL. Hasilna dinyatakan songon jumlah rata-rata nukleosida per sel.
Analisa ekspresi ni protein. Pake ma colokan Kalkulator Gambar ImageJ laho menilai ekspresi protein di PN di tingkat sel tunggal. Singkatna, di gambar konfokal lapisan tunggal saluran na hombar, marhite persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), ditanda do daerah mitokondria na patuduhon imunoreaktivitas tu antibodi tertentu di Purkina. Dung i, luas piksel di topeng na dihasilhon diukur, dung i dinormalisasi di gambar tumpukan tunggal ambang batas na hombar sian saluran mtYFP laho mandapot fraksi mitokondria sian protein na dipatuduhon.
Analisis kepadatan sel purkinje. Plug-in Penghitung Sel ImageJ dipangke laho mangevaluasi kepadatan Purkinje marhite mambagi godang ni sel Purkinje na dietong dohot ganjang ni cincin otak na diduduki sel na dietong.
Persiapan dohot papunguhon contoh. Otak sian kelompok kontrol dohot tikus Mfn2cKO diperbaiki di 2% PFA / 2,5% glutaraldehida di 0,1 M penyangga fosfat (PB), dung i diparade ma bagian koronal mamangke silia (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Ketebalan penyangga μm o% di The60). tetraoksida dohot 1,5% kalium ferosianida di suhu kamar saleleng 1 jom. Bagian-bagian i dicuci tolu hali dohot aek suling, dung i diwarnai dohot etanol 70% na marisi uranil asetat 1% saleleng 20 menit. 14040) antara slide kaca na dilapisi silikon, jala ujungna di suhu 60°C dipolimerisasi di oven. Dipillit ma luat korteks otak jala dipotong ma bagian ultratipis 50 nm di Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) jala dipillit di kisi-kisi celah tembaga 2×1 mm na dilapisi dohot film polistirena. Bagian-bagian i diwarnai dohot larutan uranil asetat 4% di H2O saleleng 10 menit, dicuci dohot H2O pigapiga hali, dung i dohot sitrat timah Reynolds di H2O saleleng 10 menit, dung i dicuci dohot H2O pigapiga hali. Mikrograf dibuat dengan mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Serikat) mamakke kamera digital TVIPS (Sistem Pengolahan Video dan Gambar Tietz) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Amerika Serikat). Jerman).
Molo tikus na hona AAV, otak dipisah jala di iris gabe bagian sagital na tebalna 1 mm, jala otak kecil dipareso mamangke mikroskop fluoresensi laho mananda cincin na hona AAV (i ma, mCherry na mengekspresihon). Holan percobaan di dia suntikan AAV manghasilhon efisiensi transduksi na mansai timbo sian lapisan sel Purkinje (i ma hampir sude lapisan) di saotikna dua cincin otak na marturut-turut do na dipangke. Loop na ditransduksi AAV dibedah mikro untuk pasca-fiksasi saborngin (4% PFA dohot 2,5% glutaraldehida di penyangga kakao 0,1 M) jala diolah selanjutna. Molo EPON penyematan, jaringan tetap dicuci dohot penyangga natrium kokot 0,1 M (Aplikem), jala diinkubasi dohot 2% OsO4 (os, Jasa Ilmu Pengetahuan; Caco) di penyangga kokot natrium 0,1 M (Aplikem) 4 Jam, dung i dicuci saleleng 2 jom. Ulang 3 hali dohot penyangga kokamida 0,1 M. Dung i, dipangke ma rangkaian etanol na manaek laho mangikubasi ganup larutan etanol di suhu 4°C saleleng 15 menit laho mambahen jaringan i dehidrasi. Jaringan i dipindahon tu propilen oksida jala diinkubasi saborngin di EPON (Sigma-Aldrich) di suhu 4°C. Lehon ma jaringan i tu EPON na baru di suhu kamar saleleng 2 jom, dung i dibahen ma i di suhu 62°C saleleng 72 jom. Pake ma ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) dohot piso berlian (Diatome, Biel, Swiss) laho mamotong bagian ultratipis 70 nm, jala noda dohot uranil asetat 1,5% saleleng 15 menit di suhu 37°C, jala noda dohot larutan timah sitrat 4 menit. Mikrograf elektron i dibuat mamakke mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) na dilengkapi dohot perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan) na dilengkapi dohot perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Laho dianalisis, dibuat ma mikrograf elektron marhite perbesaran digital 5000× manang 10.000×.
Analisa morfologis ni angka dongan. Di sude analisis, kontur ni mitokondria marsadasada digariskan secara manual di gambar digital mamangke perangkat lunak ImageJ. Marragam do paratur morfologi na dianalisa. Kepadatan mitokondria dinyatakan sebagai persentase na dapot dohot mambagi luas mitokondria total ni ganup sel dohot luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas inti sel) × 100. Kebulatan mitokondria dietong dohot rumus [4π∙2(luas)]. Morfologi ista ni mitokondria dianalisis jala dibagi gabe dua horong (“tabung” dohot “lepuh”) hombar tu bentuk utamana.
Analisis jumlah autofagosom/lisosom dohot kepadatan. Dipangke ma perangkat lunak ImageJ laho mambahen garis besar ni ganup autofagosom/lisosom di gambar digital. Luas otofagosom/lisosom dinyatakan songon persentase na dietong marhite mambagi total luas struktur otofagosom/lisosom ni ganup sel dohot luas sitoplasma (luas sitoplasma=luas sel-luas inti)×100. Kepadatan autofagosom/lisosom ihitung dohot mambagi jumlah total dohot jumlah struktur autofagosom/lisosom per sel (i segi luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel-luas inti).
Pelabelan untuk pembagian akut dohot persiapan sampel. Molo percobaan na porlu pelabelan glukosa, pindahon ma irisan otak akut tu ruang pra-inkubasi, na marisi karbon jenuh (95% O2 dohot 5% CO2), Ca2 + ACSF na timbo (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, natrium fosfat 1,25 mM. 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 dohot 2,0 mM MgCl 2, disesuaikan tu pH 7,4 dohot 310 sahat tu 320 mOsm), dimana glukosa adalah 13 C 6- Penggantian glukosa (Eurisotop, nomor katalog CLM9-1). 125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa. MgCl2, menyesuaihon tu pH 7,4 dohot 310 sahat tu 320 mOsm), jala tambahon ma 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Dibahen ma bagian-bagian i saleleng 90 menit di suhu 37°C. Di ujung ni percobaan, bagian-bagian i hatop dicuci dohot larutan berair (pH 7,4) na marisi amonium karbonat 75 mM, dung i dihomogenhon di asetonitril (ACN): metanol: aek. Dung bagian-bagian i diinkubasi di atas es saleleng 30 menit, sampel i disentrifugasi di 21.000 g saleleng 10 menit di suhu 4°C, jala supernatan na bening i dikeringkan di konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit kering na dihasilhon disimpan di suhu -80°C sahat tu na dianalisis.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa 13 asam amino berlabel C. Dibahen ma pelet metabolit i tu 75 μl aek na marmutu (sumur madu). Dung disentrifugasi di 21.000 g saleleng 5 menit di suhu 4°C, 20 μl sian supernatan na diklarifikasi i dipangke laho analisis fluks asam amino, jala sisa ekstrak i pintor dipangke laho analisis anion (ida di toru). Analisis asam amino dilakukan dengan menggunakan protokol turunan benzoil klorida naung digombarhon najolo (55, 56). Di langkah parjolo, ditambahon ma 10 μl natrium karbonat 100 mM tu 20 μl ekstrak metabolit, dung i 10 μl benzoil klorida 2% ditambahhon tu ACN kelas LC. Sampel i diputar satongkin dung i disentrifugasi di 21.000 g saleleng 5 menit di suhu 20°C. Pindahon ma luat na dibersihkan tu botol autosampel 2 ml dohot sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel dianalisis mamangke sistem LC (Air) na markinerja ultra tinggi Acquity iClass na dihubungkon tu spektrometer massa presisi resolusi tinggi Q-Eksaktif (QE)-HF (Orbit Medan Ultra Tinggi). Laho dianalisis, 2 μl sampel turunan disuntik tu kolom silika T3 kekuatan tinggi 100×1,0 mm (Air) na marisi partikel 1,8μm. Laju aliran 100μl/menit, jala sistem penyangga terdiri sian penyangga A (amonium format 10 mM dohot asam formik 0,15% di aek) dohot penyangga B (ACN). Gradienna songon on ma: 0%B di 0 menit; 0%B. 0 sahat tu 15% B di 0 sahat tu 0,1 menit; 15 sahat tu 17% B di 0,1 sahat tu 0,5 menit; B di 17 sahat tu 55% di 0,5 sahat tu 14 menit; B di 55 sahat tu 70% di 14 sahat tu 14,5 menit; di 14,5 sahat tu 70 sahat tu 100% B di 18 menit; 100% B di 18 sahat tu 19 menit; 100 sahat tu 0% B di 19 sahat tu 19,1 menit; 0% B di 19,1 sahat tu 28 menit (55, 56). 50.000. Sumber ionisasi elektrosemprotan (ESI) na ipanaskon marfungsi i tegangan semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udara sarung 60 AU (satuan sewenang-wenang), dot aliran udara bantu 20 AU. 250°S. Lensa S dibahen tu 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS asam organik na marlabel 13C. Sisa endapan metabolit (55 μl) dianalisis mamakke sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Ilmiah Termo Fisher) na dihubunghon tu spektrometer massa QE-HF ( Singkatna, 5 μl ekstrak metabolit disuntikan tu kolom Dionex IonPac AS11-HC na dilengkapi dohot HPLC (2 mm×250 mm, ukuran partikel 4 μm, Ilmiah Thermo Fisher) di bagasan mode lingkaran parsial dorong-masuk dohot rasio pengisian 1. )on. Kolom penjaga dionex ionpac ag11-hc (2 mm x 50 mm, 4 μm, termo nelayan ilmiah). Suhu ni kolom dijaga 30°C, jala otomatis sampel dibahen tu 6°C. Pake ma kartrid kalium hidroksida na diparade dohot aek na so terion laho mambahen gradien kalium hidroksida marhite pembangkit eluen. Pemisahan metabolit dengan laju aliran 380μl/menit, menerapkan gradien berikut: 0 sahat tu 3 menit, KOH 10 mM; 3 sahat tu 12 menit, KOH 10 sahat tu 50 mM; 12 sahat tu 19 menit, KOH 50 sahat tu 100 mM; 19 sahat tu 21 menit , KOH 100 mm; 21 sahat tu 21,5 menit, KOH 100 sahat tu 10 mM. Kolom i diimbangi muse di toru ni KOH 10 mM saleleng 8,5 menit.
150 μl / menit aliran suplemen isopropanol dung kolom dung i diarahhon tu spektrometer massa resolusi tinggi na beroperasi di mode ionisasi negatif. MS on mangawasi rentang massa sian m/z 50 sahat tu 750 dohot resolusi 60.000. AGC diatur tu 1×106, jala waktu ion maksimal dijaga 100 ms. Sumber ESI na dipamanas i dioperasihon di tegangan semprotan 3,5 kV. Pengaturan na asing sian sumber ion i ma songon on: suhu kapiler 275°C; aliran gas sarung, 60 AU; aliran gas bantu, 20 AU di suhu 300°C, jala pengaturan lensa S tu 60 AU.
Analisis data sian 13C na marlabel. Pake ma perangkat lunak Penjejak (versi 4.2, Ilmiah Termo Fisher) tu analisis data rasio isotop. Identitas ni ganup senyawa diverifikasi marhite senyawa acuan na boi dihaporseai jala dianalisis secara mandiri. Laho mambaen analisis pengayaan isotop, luas kromatogram ion (XIC) na iekstraksi tingon masing-masing isotop 13C (Mn) iekstraksi tingon [M + H] +, i dia n ima nomor karbon senyawa sasaran, ipake giot manganalisis asam amino sanga [ MH] + ipake giot manganalisis anion. Akurasi massa XIC hurang sian lima bagian per juta, jala akurasi RT 0,05 menit. Analisis pengayaan ilaksanaon dohot mangetong rasio masing-masing isotop na tardeteksi tu jumlah sude isotop senyawa na sasue. Rasio-rasio on dipasahat songon nilai persentase tu ganup isotop, jala hasilna dipatuduhon songon pengayaan persen molar (MPE), songon naung digombarhon di jolo (42).
Pelet neuron na beku i dihomogenhon di bagasan metanol 80% (b/b) na ngali songon es, diputar, jala diinkubasi di suhu -20°C saleleng 30 menit. Putar ma muse sampel i jala aduk ma di suhu +4°C saleleng 30 menit. Sampel i sentrifugasi di 21.000 g saleleng 5 menit di suhu 4°C, dung i dipungu ma jala dikeringkan mamangke konsentrator SpeedVac di suhu 25°C laho dianalisa di pudian ni ari. Songon na pinatorang di ginjang, dibahen ma analisis LC-MS tu asam amino ni sel na diurut. Dibahen ma analisis data mamangke massa monoisotop ni ganup senyawa. Dibahen ma paket perangkat lunak praprosesInti (57).
Persiapan irisan. Tikus i hatop dibius dohot karbon dioksida jala diponggol ulu, hatop dibuat otakna sian tangkorak, jala dipangke ma piso na margetar na gok es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) laho mamotong i gabe 300 sahat tu 375% gas karbon O5d. CO2) Ca2 + ACSF rendah (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM, CaCl2 1,0 mM dohot Adju 6,0 mM tu pH372. mOsm). Pindahon ma irisan otak na dapot tu ruangan na marisi Ca2 + ACSF na tumimbo (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, penyangga natrium fosfat 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glukosa 25,0 mM, pH2l m3C 4,0 mM. dohot 310 sahat tu 320 msm). Simpan ma irisan i saleleng 20 sahat tu 30 menit asa boi diulahon muse andorang so direkam.
rekaman. Panggung mikroskop na dilengkapi dohot ruang rekaman na tetap dohot lensa objektif immersi aek 20x (Scientifica) dipangke tu sude rekaman. Sel Purkinje na dianggap ditanda marhite (i) ukuran ni pamatang, (ii) inganan anatomi ni otak kecil, dohot (iii) ekspresi ni gen pemberita mtYFP na marsinondang. Pipet tambalan dengan tahanan ujung 5 sampai 11 megohm ditarik keluar oleh kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) dan pipet horizontal Instruments (P-1000, Caa). Sude rekaman diulahon marhite penguat penjepit tambalan npi (npi elektronik GmbH, Tam, Jerman), na dikendalihon marhite perangkat lunak Sinyal (versi 6.0, Cambridge Elektronik, Inggris). Percobaan i dicatat dohot tingkat pengambilan sampel 12,5 kHz. Sinyal i disaring dohot dua saringan Bessel na marlojong pendek dohot frekuensi potong masing-masing 1,3 dohot 10 kHz. Kapasitas ni membran dohot pipet diganti marhite rangkaian kompensasi mamangke penguat. Sude percobaan ilaksanaon i toru ni kendali kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), na ikendalikon dohot perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Rutin do dibahen dohot analisis ni sude sel. Pintor andorang so direkam, isi ma pipet i dohot larutan internal na mengandung zat-zat berikut: KCl 4,0 mM, NaCl 2,0 mM, EGTA 0,2 mM, kalium glukonat 135,0 mM, Hepes 10,0 mM, trifano. (Na) dohot kreatinin fosfat 10,0 mM disesuaihon tu pH 7,25, jala tekanan osmotik 290 mOsm (sukrosa). Pintor dung dibahen gaya 0 pA laho mangalononghon selaput i, diukur ma potensi selaput na maradian. Tahanan masukan diukur marhite na mamangke arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, dohot -10 pA. Ukur ma balga ni tanggapan tegangan jala pangke ma hukum Ohm laho mangetong resistansi masukan. Aktivitas spontan dicatat di penjepit tegangan saleleng 5 menit, jala sPSC ditanda jala diukur di Igor Pro. Kurva IV dohot arus mantap diukur marhite na manjepit baterai di potensi na marasing (mulai sian -110 mV) jala manambai tegangan di langkah 5 mV. Produksi AP diuji marhite na mamangke arus depolarisasi. Jepit ma sel i di -70 mV huhut dibahen pulsa arus depolarisasi. Sesuaihon ma ukuran ni langkah ni ganup unit rekaman secara terpisah (10 sahat tu 60 pA). Etong ma frekuensi AP maksimal marhite na manual mangetong lonjakan pulsa na mambahen frekuensi AP na tumimbo. Ambang AP dianalisis dohot mamakke turunan paduahon sian pulsa depolarisasi na parjolo memicu sada manang lobi AP.
Konfigurasi tambal berlubang dohot analisis. Patupahon rekaman tambal berlubang mamangke protokol baku. Pake ma pipet bebas ATP dohot GTP na so marisi bahan-bahan na mangihut: glukonat K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM dohot MgCl2 2 mM, jala sesuaihon ma tu pH 7,2 (mamangke KOH). ATP dot GTP ipadao tingon larutan intraseluler anso inda terkendali permeabilitas selaput sel. Pipet tambal diisi dohot larutan internal na mengandung amfoterisin (hira-hira 200 sahat tu 250 μg/ml; Amfoterisin dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (konsentrasi akhir: 0,1 sahat tu 0,3%; Konsentrasi DMSO na dipangke ndang marpanghorhon na balga tu saraf na diparsiajari. Di tingki proses tinju, torus do dipantau perlawanan saluran (Ra), jala dipungka ma percobaan dung stabil amplitudo Ra dohot AP (20-40 menit). Kegiatan spontan diukur di penjepit tegangan dohot/manang arus saleleng 2 sahat tu 5 menit. Analisis data dilakukan dengan menggunakan Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, Amerika Serikat), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Amerika Serikat) dohot GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc. Amerika Serikat). Asa boi ditanda angka AP na spontan, dipangke ma plug-in NeuroMatic v3.0c ni IgorPro. Otomatis mananda AP mamakke ambang batas na dilehon, na disesuaihon marsadasada tu ganup catatan. Manggunahon selang lonjakan, tontuhon ma frekuensi lonjakan dohot frekuensi lonjakan seketika maksimal dohot frekuensi lonjakan rata-rata.
PN isolasi do. Marhite na menyesuaihon diri tu protokol naung diterbithon najolo, PNs dimurnihon sian otak tikus di tahap na ditontuhon (58). Singkatna, otak kecil dibedah jala digiling di media disosiasi na ngali songon es [tanpa HBSS Ca2+ dohot Mg2+, ditambahi dohot glukosa 20 mM, penisilin (50 U/ml) dohot streptomisin (0,05 mg/ml)], dung i dicerna media i dohot mgHC1-ml. Rawat selama 30 menit pada suhu 30°C. Parjolo dicuci jaringan i di media HBSS na marisi lendir telur (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) dohot DNase (0,1 mg/ml) di suhu kamar asa unang pencernaan enzimatik, dung i di media HBSS na marisi glukosa 20 mM), digiling lembut di HBmylm5. (0,05 mg/ml) dohot DNase (0,1 mg/ml) mangalehon sel tunggal. Suspensi sel na dihasilhon i disaring marhite saringan sel 70 μm, dung i sel-sel i dipelet marhite sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) jala disuspensi muse di media penyortiran [HBSS, ditambahi dengan glukosa 20 mM, stremilin janin janin) Serum, (0,05 mg/ml)]; menilai daya tahan sel dohot propidium yodida jala menyesuaihon kepadatan sel tu 1×106 sahat tu 2×106 sel/ml. Andorang so sitometri aliran, suspensi i disaring marhite saringan sel 50 μm.
Sitometer aliran do i. Dibahen ma penyortiran sel di suhu 4°C mamangke mesin FACSAria III (BD Bioilmu) dohot perangkat lunak FACSDiva (BD Bioilmu, versi 8.0.1). Suspensi sel i diurut mamakke nozzle 100 μm di toru ni tekanan 20 psi dohot kecepatan ~2800 peristiwa/detik. Alani kriteria gerbang tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, dohot ciri-ciri hamburan) ndang boi memastikan isolasi PN na tingkos sian jenis sel na asing, strategi gerbang diatur marojahan tu perbandingan langsung intensitas YFP dohot autofluoresensi di mitoYFP + dohot mitoYFP kontrol − YFP terganggu dohot menyinari sampel dohot garis laser 488 nm, jala sinyal i dideteksi mamangke saringan lewat pita 530/30 nm. I tikus mitoYFP+, gogo relatif gen wartawan Rosa26-mitoYFP juo ipake giot mambedaon badan saraf dot serpihan akson. 7-AAD dieksitasi dohot laser kuning 561 nm jala dideteksi marhite saringan pita 675/20 nm laho mangambolongkon sel na mate. Asa boi dipisah astrosit di tingki na sarupa, suspensi sel i diwarnai dohot ACSA-2-APC, dung i sampel i disinarhon dohot garis laser 640 nm, jala dipangke ma saring-saring pita 660/20 nm laho mangalului sinyal i.
Sel-sel na dipungu i dipelet marhite sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) jala disimpan di suhu -80°C sahat tu na dipangke. Tikus Mfn2cKO dohot anak ni sampahna digoari di ari na sarupa laho meminimalkan variabilitas prosedur. Dibahen ma dohot analisis data FACS mamangke perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Amerika Serikat).
Songon na nidok di ginjang (59), PCR waktu nyata dipangke laho mangisolasi DNA sian saraf na diurut laho mangukur mtDNA na mangihut. Linieritas dohot sensitivitas ambang batas mulana diuji marhite na mangulahon qPCR di angka sel na marasing. Singkatna, papungu ma 300 PN di bagasan penyangga lisis na terdiri sian tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween 20 0,5% dohot proteinase K (200 ng/ml) jala diinkubasi di suhu 55°C 120 menit. Selanjutna diinkubasi di suhu 95°C saleleng 10 menit laho memastikan inaktivasi lengkap ni proteinase K. Sains, nomor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Ilmiah Termo Nelayan, nomor katalog AIVI3E8) dohot 18S (Ilmiah Termo Nelayan, nomor katalog Hs99999901_s1) gen.
Persiapan sampel ni proteom. °C saleleng 10 menit jala disonikasi, di penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida dohot 100 mM tris- HC pelet di neuron beku]. On Bioruptor (Diagenode) selama 10 menit (pulsa 30 detik / masa jeda 30 detik). Sampel diencerkan 1:10 di tris-HCl 20 mM (pH 8,0), dicampur dohot emas tripsin (Promega) 300 ng, jala diinkubasi saborngin di suhu 37°C asa boi lengkap pencernaan. Di ari paduahon, dibahen ma sampel i tu 20.000 g saleleng 20 menit. Diencerkan ma dohot asam formik 0,1%, jala larutan i dihapus dohot StageTips na dibahen sandiri. Sampel i dikeringkon di bagasan alat SpeedVac (konsentrator Eppendorf ditambah 5305) di suhu 45°C, dung i peptida i digantung di bagasan asam formik 0,1%. Sude sampel diparade serentak sian halak na sarupa. Laho manganalisis sampel astrosit, 4 μg peptida na so asin dicap dohot tanda massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110) dohot rasio reagen peptida tu TMT 1:20. Tu pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT disuspensi ulang di 70 μl ACN anhidrat, jala peptida na kering i dibahen muse gabe 9 μl TEAB 0,1 M (trietilamonium bikarbonat), tu na ditambahhon 7 μl reagen TMT di ACN. Konsentrasi ni nasida 43,75%. Dung 60 menit inkubasi, reaksi i dipadam dohot 2 μl hidroksilamin 5%. Peptida na marlabel i dipungu, dikeringkan, disuspensi muse di 200μl asam formik (FA) 0,1%, dibagi gabe dua, dung i dihapus asin mamangke StageTips na dibahen sandiri. Dipangke ma sada sian dua bagian i difraksihon di kolom kromatografi Acquity 1 mm x 150 mm na diisi dohot partikel C18 130 Å 1,7 μm (NoWaters, catalog150). Termo Nelayan Ilmiah). Peptida na dipisah dohot laju aliran 30μl/menit, dipisah sian 1% sahat tu 50% penyangga B saleleng 85 menit dohot gradien bertahap 96 menit, sian 50% sahat tu 95% penyangga B saleleng 3 menit, dung i 8 menit tu 95 % Penyangga B; Penyangga A ima ACN 5% dohot ABC 10 mM, jala penyangga B ima ACN 80% dohot ABC 10 mM. Papungu ma angka pecahan ganup 3 menit jala padomu ma i gabe dua kelompok (1 + 17, 2 + 18, dna) jala kering ma i di sentrifugal vakum.
Analisa MS/MS. Dipisahkan ma peptida (nomor r119.aq) di kolom analisis U. 1200 (Ilmiah Nelayan Termo, Jerman). Kolom i dijaga di suhu 50°C. Penyangga A dohot B ima 0,1% asam formik di aek dohot 0,1% asam formik di 80% ACN. Peptida dipisah dohot gradien bertahap 200 nl/menit sian 6% sahat tu 31% penyangga B saleleng 65 menit, jala sian 31% sahat tu 50% penyangga B saleleng 5 menit. Peptida na dielusi dianalisis di spektrometer massa fusi orbitrap. Pangukuran m/z awal peptida diulahon dohot resolusi 120.000 di kisaran 350 sahat tu 1500 m/z. Manggunahon 27% energi tabrakan na dinormalisasi, prekursor na gumogo dohot keadaan muatan 2 sahat tu 6 dipillit tu pembelahan disosiasi jebakan C (HCD) energi na timbo. Waktu siklus diatur tu 1 s. Nilai m/z ni serpihan peptida diukur di jebakan ion mamangke sasaran AGC na ummetmet 5×104 dohot tingki suntikan maksimal 86 ms. Dung marpecah-pecah, dibahen ma prekursor i tu daftar pengecualian dinamis saleleng 45 s. 164942), jala spektrum migrasi dianalisis di spektrometer massa tribrid orbitrap lumos (spektrometer massa tribrid lumos sebagai bidang gelombang tinggi dengan 50 cm). MS3 na dipillit marojahan tu sinkronisasi prekursor dipangke tu pangukuran sinyal ion laporan TMT. 1200, mamakke elusi gradien linier 90%, dohot konsentrasi penyangga 6% sahat tu 31%; penyangga A ima 0,1% FA, jala penyangga B ima 0,1% FA dohot 80% ACN. Kolom analisis dioperasihon di suhu 50°C. Pake ma Gaya Bebas (versi 1.6, Termo Nelayan Ilmiah) laho mambagi file asli hombar tu tegangan kompensasi FAIMS.
Panandaon dohot pangukuran ni protin. Marhite mesin pencarian Andromeda na terpadu, data asli dianalisis mamangke MaxQuant versi 1.5.2.8. Salain urutan Cre rekombinase dohot YFP na dapot sian Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida dilului urutan kanonik dohot urutan isoform proteom acuan tikus (ID proteom UP000000589, diunduh sian UniProt di bulan Mei2020). Oksidasi metionin dohot asetilasi N-ujung protein diatur songon parubahan na marragam; metilasi sistein karbamoil diatur sebagai modifikasi tetap. Parameter pencernaan diatur tu “kekhususan” dohot “tripsin/P”. Jumlah minimal peptida dohot peptida silet na dipangke laho mananda protein ima 1; Di kondisi pencocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein 0,01. Dibahen ma opsi “Peptida Paduahon”. Pangke ma opsi “cocok antar lari” laho papindahon tanda na sukses antar file asli na marasing. Pake ma rasio minimal LFQ hitungan 1 untuk pengukuran bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ disaring tu saotikna dua nilai na sah di saotikna sada kelompok genotipe di ganup titik waktu, jala diekstrapolasi sian parserahan normal dohot lebar ni. 0,3 jala tu toru 1,8. Dipangke ma platform komputasi Perseus dohot R laho manganalisis hasil LFQ. Uji t sedang dua arah sian paket perangkat lunak limma dipangke laho analisis ekspresi perbedaan (61). Analisis data eksplorasi dilakukan dengan menggunakan ggplot, faktominer, faktoekstra, ggally dan pheatmap. Data proteomik berbasis TMT dianalisis mamangke versi MaxQuant 1.6.10.43. Dilului ma data proteomik mentah sian basis data proteomik manusia UniProt, na diunduh di bulan September 2018. Analisa i manggohi faktor koreksi kemurnian isotop na diparade pabrik. Anggo limma di R laho analisis ekspresi perbedaan. Data asli, hasil pencarian basis data, dohot alur kerja dohot hasil analisis data sude disimpan di aliansi ProteomeXchange marhite gudang mitra PRIDE dohot pengidentifikasi kumpulan data PXD019690.
Anotasi fungsional mambahen lam mamora analisis i. Dipangke do alat Analisis Jalur Kecerdasan (QIAGEN) laho manontuhon hamoraon ni istilah anotasi fungsional ni data na dipungu di 8 minggu (Gambar 1). Singkatna, daftar protein kuantitatif na dapot sian analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) dipangke dohot kriteria saringan na mangihut: Mus musculus dipillit gabe spesies dohot latar belakang, jala kategori patuduhon nilai P na disesuaihon ni Benjamini tu pengayaan 0,05 manang na tumoru dianggap signifikan. Tu grafik on, dipatuduhon do lima kategori kelebihan na parjolo di ganup kluster marojahan tu nilai P na disesuaihon. Dibahen ma analisis ekspresi protein pardalanan ni tingki tu angka calon na ringkot na ditanda di ganup kategori, jala ganup baris dianalisa secara terpisah. Ndang pola ingkon mangadopsi SD na konsisten.
Laho mambandinghon hasil ni penelitian on dohot basis data na diterbithon jala mambahen diagram Venn di Gambar 1, dipasada hami ma daftar protein kuantitatif dohot anotasi MitoCarta 2.0 (24). Pangke ma alat online Gambarhon Diagram Venn laho mambahen diagram i.
Molo naeng mamboto hatorangan na dumenggan taringot tu cara statistik na dipangke laho mangulahon analisis proteomik, ida ma bagian na hombar tu Bahan dohot Cara. Tu sude parcubaan na asing, hatorangan na rinci boi do dapot di legenda na hombar tusi. Molo so adong na asing, sude data dipatuduhon songon rata-rata ± SEM, jala sude analisis statistik diulahon mamangke perangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Molo naeng mandapot bahan tambahan tu artikel on, ida ma di http://www.
On ma sada artikel akses terbuka na dibagihon di toru ni ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, na mangizinhon pangkeon, distribusi dohot reproduksi di media aha pe, asal ma pangkeon akhirna ndang tu keuntungan komersial jala premisna ima molo karya aslina tingkos. Bona.
Catatan: Holan mangido do hami asa dilehon hamu alamat emailmuna asa diboto halak na disaranhon hamu tu halaman i na lomo rohamuna mangida email i jala ndang spam. Ndang na laho manangkap hami alamat email.
Sungkunsungkun on dipangke laho manguji molo hamu pengunjung jala mangambati pengajuan spam otomatis.
Dipaboa ibana do tu buku on. Larson
Analisis proteomik saraf na so marfungsi mangungkaphon molo program metabolisme diaktifhon laho mangalo degenerasi saraf.
Dipaboa ibana do tu buku on. Larson
Analisis proteomik saraf na so marfungsi mangungkaphon molo program metabolisme diaktifhon laho mangalo degenerasi saraf.
©2020 Punguan Amerika tu Kemajuan Ilmu Pengetahuan. sude hak dijaga. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, CrossRef dan COUNTER. 2375-2548.