Artikel on bagian sian topik penelitian “Meningkatkan ketahanan kacang-kacangan terhadap patogen dan hama”, lihat semua 5 artikel
Agen kausal ni nekrosis sahit tumbuhan jamur Sklerotinia sklerotiorum (Lib.) de Bary mamakke strategi martingkat laho manginfeksi tumbuhan inang na marasing. Studi on mangusulkon pamakean diamin L-ornitin, sada asam amino non-protein na marangsang sintesis asam amino esensial lainna, manjadi strategi pangalolaan alternatif giot maningkatkon tanggapan molekuler, fisiologis dot biokimia Phaseolus vulgaris L. Percobaan in vitro patuduhon molo L-ornitin marlapatan mangambati pertumbuhan miselium S. Lobi sian i, boi do i mangurangi parah ni jamur na bontar di kondisi rumah kaca. Dung i, L-ornitin merangsang pertumbuhan ni suansuanan na dirawat, na patuduhon konsentrasi L-ornitin na diuji ndang fitotoksik tu suansuanan na dirawat. Asing ni i, L-ornitin meningkatkan ekspresi antioksidan non-enzimatik (fenolik larut total dohot flavonoid) dohot antioksidan enzimatik (katalase (CAT), peroksidase (POX), dohot polifenol oksidase (PPO)), jala meningkatkan ekspresi tolu gen na marpardomuan tu antioksidan, PGRv1. Dung i, diida ibana ma adong protein oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) na dianggap di genom S. (PlOAH) sian segi analisis fungsi, domain na dilestarihon, dohot topologi. Na menarik, penambahan L-ornitin tu media kaldu dekstrosa kentang (PDB) secara signifikan menurunkan ekspresi gen SsOAH di miselium S. Songon i ma, aplikasi eksogen L-ornitin marlapatan manurunhon ekspresi gen SsOAH di miselium jamur na dipungu sian suansuanan na dirawat. Na parpudi, aplikasi L-ornitin secara signifikan menurunkan sekresi asam oksalat baik di media PDB dohot bulung na terinfeksi. Simpulna, L-ornitin marperan kunci i manjago status redoks songoni juo maningkatkon tanggapan pertahanan suan-suanan na terinfeksi. Hasil ni penelitian on boi mangurupi di na mangembanghon metode na inovatif, ramah lingkungan laho mangatur jamur na bontar jala mangurangi panghorhonna tu produksi kacang dohot suansuanan na asing.
Jamur na bontar, na dibahen jamur nekrotrofik Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ima sahit na mangagohon, na mangurangi hasil na mambahen ancaman na balga tu produksi kacang global (Bolton dkk., 2006). Sklerotinia sclerotiorum ima salah sada patogen tumbuhan jamur na paling sulit dikendalikon, dohot jangkauan inang na luas lobi tingon 600 spesies tumbuhan dot kemampuan na cepat macerasi jaringan inang dohot cara na inda spesifik (Liang dot Rollins, 2018). I bagasan kondisi na inda denggan, ia mangalami fase kritis siklus hidupna, tinggal inda marfungsi i bagasan jangka waktu na leleng songon struktur na hitam, karas, songon boni na idokon 'sklerotia' i tano sanga songon pertumbuhan na bontar, na marbulu i miselium sanga pith batang ni suan-suanan na hona infeksi (5). S. sclerotiorum mampu mambaen sklerotia, na mambaen ia bisa martahan i ladang na hona infeksi i jangka waktu na leleng dot bisa martahan i maso sahit (Schwartz dkk., 2005). Sklerotia kayo gizi, bisa martahan i tano salolotna, dot manjadi inokulum utama tu infeksi na mangihut (Schwartz dkk., 2005). I kondisi na denggan, sklerotia martunas dot manghasilkon spora udara na bisa manjangkit sude bagian i ginjang tano suan-suanan, tarmasuk tai inda tarbatas tu bunga, batang, sanga polong (Schwartz dkk., 2005).
Sklerotinia sklerotiorum mamake strategi multi-tingkat giot manginfeksi suansuanan inangna, na mangalibatkon rangkaian kajadian na tarkoordinasi tingon perkecambahan sklerosis sampe parkembangan gejala. I mulana, S. sclerotiorum manghasilkon spora na tersuspensi (idokon askospora) tingon struktur songon jamur na idokon apothecia, na manjadi udara dot markembang manjadi sklerotia non-motil i puing-puing tumbuhan na terinfeksi (Bolton dkk., 2006). Jamur on dungni mangaluarkon asam oksalat, sada faktor virulensi, giot mangatur pH dinding sel ni suan-suanan, mandorong degradasi enzimatik dot invasi jaringan (Hegedus dot Rimmer, 2005), dot manekan ledakan oksidatif suan-suanan inangna. Proses pengasaman on mambahen gale dinding sel ni suansuanan, mambahen lingkungan na menguntungkan tu operasi normal dohot efisien ni enzim penurunan dinding sel jamur (CWDE), na mambahen patogen boi mangatasi penghalang fisik jala manembus jaringan inang (Marciano dkk., 1983). Molo dung itembus, S. Perkembangan lesi dohot tikar hifal manghorhon tu gejala khas jamur putih (Hegedus dan Rimmer, 2005). Samantaro i, suan-suanan inang mananda pola molekuler na markaitan dohot patogen (PAMP) marhite reseptor panandaon pola (PRR), na mamicu sarangkaian kajadian sinyal na ujungna mangaktifhon tanggapan partahanan.
Bope puluhan taon usaho mangatur sahit, hahurangan germplasma tahan na cukup totop di kacang, songon i hasil panen komersial na asing, ala ni ketahanan, kelangsungan hidup, dohot kemampuan beradaptasi ni patogen. Alani i, pangaturon ni sahit mansai maol jala porlu strategi na terpadu, marragam na mambahen kombinasi praktek budaya, pengendalian biologis, dohot fungisida kimia (O’Sullivan dkk., 2021). Pengendalian kimia jamur putih ima na paling efektif harana fungisida, molo igunakon dohot tingkos dot i waktu na pas, bisa efektif mangatur pararaton ni sahit, mangurangi parah ni infeksi, dot meminimalkon karugian hasil. Alai, molo marlobi-lobi pangkeon dohot marlobi-lobi mangasahon fungisida boi do mambahen tubu galur S. Alani i, gabe sada ulaon na rumingkot do mangalului dalan na ramah lingkungan.
Poliamin (PA), songon putresin, spermidin, spermin, dohot kadaverin, boi do gabe alternatif na marjanji mangalo patogen suansuanan na diboan tano, marhite i boi do sasintongna manang sebagian mangurangi pangkeon ni fungisida kimia na marbahaya (Nehela dkk., 2024; Yi2 dkk., 2). I suan-suanan na lobi ginjang, PA tarlibat i bahat proses fisiologis tarmasuk, tai inda tarbatas tu, pambagian sel, diferensiasi, dot tanggapan tu tekanan abiotik dot biotik (Killiny dot Nehela, 2020). Nasida boi marfungsi songon antioksidan, mangurupi mangalap spesies oksigen reaktif (ROS), manjaga homeostasis redoks (Nehela dohot Killiny, 2023), manginduksi gen na marpardomuan tu pertahanan (Romero dkk. 2019), pajongjonghon ketahanan na didapot secara sistemik (SAR), dohot mangatur interaksi suansuanan-patogen (Nehela dohot Killiny, 2020; Asija dkk., 2022; Siparrohahonon do, mekanisme dohot peran khusus ni PA di pertahanan ni suansuanan marragam do hombar tu spesies ni suansuanan, patogen, dohot kondisi lingkungan. PA na paling godang di suansuanan ima biosintesis sian poliamin esensial L-ornitin (Killiny dan Nehela, 2020).
L-ornitin marperan marragam i partumbuhan dot parkembangan suan-suanan. Misalna, penelitian na salpu nunga patuduhon molo di boras (Oryza sativa), ornitin boi do marpardomuan tu daur ulang nitrogen (Liu dkk, 2018), hasil boras, kualitas dohot aroma (Lu dkk, 2020), dohot tanggapan stres aek (Yang dkk, 2000). 2019. (Hussein dkk., 2019) dohot meringankan stres garam di bawang (Allium Cepa) (Allium Cepa) Rocha dohot donganna, taon 2012). Peran potensial L-ornitin i pertahanan stres abiotik mungkin arani parsidohotonna i akumulasi prolin i suan-suanan na irawat. Misalna, gen na marpardomuan tu metabolisme prolin, songon gen ornitin delta aminotransferase (delta-OAT) dohot prolin dehidrogenase (ProDH1 dohot ProDH2), najolo nunga dibaritahon na tarlibat di partahanan ni Nicotiana benthamiana dohot Arabidopsis thalianga mangalo Pse non-induk dohot Pse 2012 taon 2012). Di sisi na asing, jamur ornitin dekarboksilase (ODC) dihaporluhon tu pertumbuhan patogen (Singh dkk., 2020). Penargetan ODC ni Fusarium f. sp. lycopersici marhite pembungkaman gen na dibahen inang (HIGS) marlapatan meningkatkan ketahanan ni suansuanan tomat tu layu Fusarium (Singh dkk., 2020). Alai, peran potensial ni aplikasi ornitin eksogen mangalo tekanan biotik songon fitopatogen ndang denggan diparsiajari. Na lobi ponting, efek ni ornitin tu ketahanan tu sahit dohot fenomena biokimia dohot fisiologis na mardomu tusi, godang dope na so disulingkiti.
Mangantusi kompleksitas infeksi S. Di bagasan penelitian on, hami martujuan laho mananda peran potensial ni diamin L-ornitin songon faktor kunci laho pagandahon mekanisme pertahanan dohot ketahanan ni suansuanan kacang-kacangan tu infeksi Sklerotinia. Hami marhipotesis molo, salain pagandahon tanggapan pertahanan ni suansuanan na terinfeksi, L-ornitin pe marperan kunci laho mampartahanhon status redoks. Diusulhon hami do asa efek potensial ni L-ornitin marpardomuan tu pangaturan ni mekanisme pertahanan antioksidan enzimatik dohot non-enzimatik dohot gangguan tu faktor patogenitas / virulensi jamur dohot protein na mardomu tusi. Fungsi ganda ni L-ornitin on mambahen ibana gabe calon na marjanji tu strategi na berkelanjutan laho mangurangi dampak ni jamur na bontar jala pagandahon ketahanan ni tanaman kacang-kacangan umum tu patogen jamur na gogo on. Hasil ni penelitian on boi mangurupi di pengembangan metode na inovatif, ramah lingkungan laho mangatur jamur na bontar dohot mangurangi panghorhonna tu produksi kacang-kacangan.
Di penelitian on, ragam ni kacang umum na rentan dijual, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), dipangke gabe bahan percobaan. Boni na sehat burju do diparade Departemen Penelitian Kacang-kacangan, Lembaga Penelitian Tanaman Ladang (FCRI), Pusat Penelitian Pertanian (ARC), Mesir. Lima boni disaburhon di pot plastik (diameter dalam 35 cm, bagas 50 cm) na diisi dohot tano na hona S. Di 7-10 ari dung manabur (DPS), ditipishon ma bibit i asa holan dua bibit na seragam partubuna jala tolu bulung na gok di ganup pot. Sude suansuanan na di pot disiram sahali dua minggu jala dipupuk ganup bulan hombar tu tingkat na disaranhon tu ragam na nilehon.
Laho paradehon konsentrasi 500 mg/L L-ornitindiamin (na digoari muse asam (+)-(S)-2,5-diaminopentanoat; 50 mg parjolo dilarutkan di bagasan 100 mL aek suling steril. Larutan saham i dung i diencerkan jala dipangke di percobaan na mangihut. Singkatna, onom rangkaian konsentrasi L-ornitin (12,5, 25, 50, 75, 100, dohot 125 mg/l) diuji secara vitro. Dibahen ma aek suling na steril gabe kontrol negatif (Mock) jala fungisida komersial “Rizolex-T” 50% bubuk na boi dibasahon (toklofos-metil 20% + tiram 30%; songon kontrol na denggan. Fungisida komersial “Rizolex-T” diuji secara vitro di lima konsentrasi (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L).
Sampel batang dohot polong kacang umum na patuduhon gejala khas jamur putih (tingkat serangan: 10-30%) dipungu sian peternakan komersial. Nang pe godangan bahan suansuanan na terinfeksi i ditanda sian spesies/ragam (ragam komersial na rentan Giza 3), na asing, tarlumobi na dapot sian pasar lokal, sian spesies na so binoto. Bahan-bahan na terinfeksi na dipapungu i parjolo didesinfeksi permukaan dohot larutan natrium hipoklorit 0,5% saleleng 3 menit, dung i dibilas pigapiga hali dohot aek suling steril jala diapus kering dohot kertas saringan steril laho mambuat aek na marlobi. Organ na terinfeksi i dung i dipotong ma gabe potongan-potongan na metmet sian jaringan partongaan (antara jaringan na sehat dohot na terinfeksi), dibudidayahon di media agar dekstrosa kentang (PDA) jala diinkubasi di suhu 25 ± 2 °C dohot siklus cahaya 12 j/gelap 12 j saleleng 5 ari laho merangsang pembentukan sklerotia . Metode ujung miselium pe dipangke laho mamurnihon isolasi jamur sian kultur na marcampur manang na terkontaminasi. Isolasi jamur na dimurnihon parjolo ditanda marojahan tu ciri-ciri morfologis budayana dung i diparhatopot gabe S. Na parpudi, sude isolasi na dimurnihon diuji patogenitasna di kultivar kacang umum Giza 3 na rentan laho manggohi postulat ni Koch.
Asing ni i, isolasi S. Singkatna, isolasi dibudidayahon di kaldu dekstrosa kentang (PDB) jala diinkubasi di suhu 25 ± 2 °C saleleng 5-7 ari. Dung i, dipapungu ma miselium jamur, disaring marhite kain keju, dicuci dua hali dohot aek na steril, jala dihariarahon marhite kertas saringan na steril. DNA genom diisolasi mamakke Kit Miniprep Jamur/Bakteri Quick-DNA TM (Quick-DNATM). 2017 : 540 bp. Produk PCR na dimurnihon i dipasahat laho diurut (Bioteknologi Beijing Aoke Dingsheng). Urutan rDNA ITS diurut dua arah mamakke metode urutan Sanger. Urutan ni pangidoan na dipungu i dung i dibandingkon ma tu data na imbaru di GenBank dohot Pusat Informasi Bioteknologi Nasional (NCBI) mamangke perangkat lunak BLASTn. Urutan ni pangidoan i dibandinghon dohot 20 galur/isolasi S. Analisis evolusi dilakukan mamakke metode kemungkinan maksimal dohot model penggantian nukleotida umum na boi dibalikhon tingki (Nei dohot Kumar, 2000). Dipatuduhon do hau na markemungkinan log na tumimbo. Pohon awal tu pencarian heuristik dipillit marhite na mamillit pohon na tumimbo kemungkinan logna antara pohon tetangga-bergabung (NJ) (Kumar dkk., 2024) dohot pohon parsimoni maksimal (MP). Pohon NJ dibangun mamakke matriks jarak berpasangan na dietong mamakke model umum na boi dibalikhon tingki (Nei dohot Kumar, 2000).
Aktivitas antibakteri L-ornitin dohot bakterisida “Rizolex-T” ditontuhon secara vitro marhite metode difusi agar. Cara : Dibuat ma godang ni larutan saham L-ornitin (500 mg/L) na hombar jala dicampur ma denggan dohot 10 ml media gizi PDA laho paradehon larutan na konsentrasi akhirna masing-masing 12,5, 25, 50, 75, 100 dohot 125 mg/L. Lima konsentrasi fungisida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L) dohot aek suling steril dipangke gabe kontrol. Dung media i padat, colokan miselium na baru diparade sian kultur Sclerotinia sclerotiorum, diameterna 4 mm, dipindahon tu pusat ni piring Petri jala dibudidayahon di suhu 25±2°C sahat tu na ditutupi miselium i sude piring Petri kontrol, dung i dicatat ma pertumbuhan jamur. Hitung ma persentase penghambatan pertumbuhan radial S.
Percobaan i diulahi dua hali, dohot onom ulangan biologis tu ganup kelompok kontrol/percobaan dohot lima pot (dua suansuanan per pot) tu ganup ulangan biologis. Ganup ulangan biologis dianalisis dua hali (dua ulangan teknis) laho mamastihon ketepatan, keandalan dohot keterproduksi ni hasil percobaan. Asing ni i, dipangke do analisis regresi probit laho mangetong konsentrasi penghambat satonga maksimal (IC50) dohot IC99 (Prentice, 1976).
Laho menilai potensi L-ornitin di kondisi rumah kaca, dibahen ma dua percobaan pot na marturut-turut. Singkatna, digohi ma hudon i dohot tano liat-pasir naung disterilhon (3:1) jala diinokulasi dohot kultur S. Parjolo, isolasi na paling invasif sian S. Opat colokan agar diameter 5 mm dung i dibuat sian ujung parjolo jala diinokulasi dohot 100 g campuran steril eme dohot dedak beras (1:1, v/v) jala sude labu diinkubasi di suhu 25 ± 2 °C di toru ni siklus 12 j terang/12 j golap merangsang pembentukan scotisia saleleng 5. Isi ni sude labu dicampur do denggan asa homogen andorang so ditambai tano. Dung i, ditambai ma 100 g campuran dedak penjajah tu ganup hudon asa tongtong konsentrasi ni patogen. Pot na diinokulasi i disiram asa boi tubu jamur jala dibahen di kondisi rumah kaca saleleng 7 ari.
Dung i, disabur ma lima boni sian ragam Giza 3 tu ganup hudon. Molo pot na dirawat dohot L-ornitin dohot fungisida Rizolex-T, jolo direndam ma boni na disterilhon i saleleng dua jom di larutan berair ni dua senyawa i dohot konsentrasi IC99 akhir hira-hira 250 mg/L dohot 50 mg/L, dung i dikeringkan di udara selama satu jam. Di sisi na asing, dibahen ma boni i tu aek suling na steril songon kontrol negatif. Dung 10 ari, andorang so disiram parjolo, ditipis ma tunas i, holan dua tunas na rapi ma tading di ganup hudon. Tamba ni i, laho memastikan infeksi dohot S. Suan-suanan kontrol sarupa do lukana jala godang na dos (0,5 g) campuran dedak na steril, na so terjajah dibahen tu luka i jala dijaga di toru ni kelembaban na timbo laho maniru lingkungan tu perkembangan ni sahit jala memastikan konsistensi antar kelompok pengobatan.
Cara pengobatan : Bibit kacang disiram dohot 500 ml larutan berair L-ornitin (250 mg/l) manang fungisida Rizolex-T (50 mg/l) marhite na mangasiram tano, dung i diulahi ma pengobatan i tolu hali di selang 10 ari. Kontrol na dirawat plasebo disiram dohot 500 ml aek suling steril. Sude perawatan diulahon di kondisi rumah kaca (25 ± 2°C, kelembaban relatif 75 ± 1%, dohot fotoperiode 8 j terang/16 j golap). Sude pot disiram dua minggu jala dirawat ganup bulan dohot pupuk NPK na seimbang (20-20-20, dohot 3,6% belerang dohot unsur mikro TE; Bibit Zain, Mesir) di konsentrasi 3-4 g/l marhite penyemprotan bulung hombar tu anjuran tu varietas dohot pabrik na khusus. Molo so dipaboa na asing, bulung naung matoras na gok (bulung paduahon dohot patoluhon sian ginjang) dipapungu sian ganup ulangan biologis di 72 h pasca perawatan (hpt), dihomogenhon, dipungu jala disimpan di -80 °C laho analisis selanjutna termasuk, alai ndang terbatas tu, indikator lokal peroksidasi histokimia, dohot antioksidan na so marenzim dohot ekspresi gen.
Intensitas ni infeksi jamur putih dinilai ganup minggu 21 ari dung inokulasi (dpi) mamangke skala 1-9 (Tabel Tambahan S2) na marojahan tu skala Petzoldt dohot Dickson (1996) na dimodifikasi Teran dkk. (2006). Singkatna, batang dohot ranting ni suansuanan kacang dipareso mulai sian titik inokulasi laho mangihuthon perkembangan ni lesi di sepanjang antar simpul dohot simpul. Dung i diukur ma jarak ni lesi sian titik inokulasi tu titik na dao di sepanjang batang manang ranting jala dibahen ma skor 1-9 berdasarkan inganan ni lesi, di na (1) patuduhon ndang adong infeksi na tarida jonok tu titik inokulasi jala (2-9) patuduhon peningkatan bertahap di ukuran lesi noulong a/S dohot Tabel S2). Intensitas ni infeksi jamur putih dung i diubah gabe persentase mamangke rumus 2:
1977), na baru-baru on disesuaihon tu busuk putih ni kacang biasa (Chauhan dkk., 2020) mamangke persamaan 3:
Di dia Yi = parah ni sahit di tingki ti, Yi+1 = parah ni sahit di tingki na mangihut ti+1, ti = tingki pangukuran na parjolo (di ari), ti+1 = tingki pangukuran na mangihut (di ari), n = godang ni titik waktu manang titik pengamatan. Parameter pertumbuhan ni suansuanan kacang termasuk timbo ni suansuanan (cm), godang ni ranting per suansuanan, dohot godang ni bulung per suansuanan dicatat ganup minggu saleleng 21 ari di sude ulangan biologis.
Di ganup replika biologis, sampel bulung (bulung na gok berkembang paduahon dohot patoluhon sian ginjang) dipungu di ari 45 dung diubati (15 ari dung diubati parpudi). Ganup replika biologis terdiri sian lima pot (dua suansuanan per pot). Hira-hira 500 mg sian jaringan na dihancurhon i dipangke laho mambuat pigmen fotosintesis (klorofil a, klorofil b dohot karotenoid) mamangke aseton 80% di suhu 4 °C di inganan na holom. Dung 24 h, sampel disentrifugasi jala supernatan dipungu laho manontuhon kandungan klorofil a, klorofil b dohot karotenoid secara kolorimetri mamangke spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang) hombar tu metode ni panjang gelombang (A470, A646 dan A663 nm). Na parpudi, isi ni pigmen fotosintesis dietong mamangke rumus 4-6 na digombarhon ni Lichtenthaler (1987).
Di 72 h pasca perawatan (hpt), bulung (bulung paduahon dohot patoluhon naung gok berkembang sian ginjang) dipapungu sian ganup ulangan biologis laho lokalisasi histokimia in situ ni hidrogen peroksida (H2O2) dohot anion superoksida (O2•−). Ganup replika biologis terdiri sian lima pot (dua suansuanan per pot). Ganup ulangan biologis dianalisis marganda (dua ulangan teknis) laho mamastihon ketepatan, keandalan dohot keterproduksi ni metode i. H2O2 dohot O2•− ditontuhon mamangke 0,1% 3,3′-diaminobenzidin (DAB; (2004) dohot si Adam dkk. (1989) dohot parubahan na gelleng. Untuk lokalisasi histokimia H2O2 di ingananna, selebaran disusupi vakum dohot DAB 0,1% di penyangga Tris 10 mM (pH 7,8) dung i diinkubasi di suhu kamar di cahaya saleleng 60 min. Lembar diputihkan di TCA 0,15% (v/v) di etanol:kloroform 4:1 (v/v) dung i dibahen tu panondang sahat tu na holom. Songon i ma nang katup disusupi vakum dohot penyangga kalium fosfat 10 mM (pH 7,8) na marisi 0,1 w/v % HBT laho lokalisasi histokimia O2•− di ingananna. Diinkubasi ma bulung-bulung i di bagasan panondang di suhu kamar saleleng 20 min, dung i diputihhon songon na di ginjang i, dung i dipatiur ma sahat tu na tarida bintik-bintik biru/violet tua. Intensitas ni warna coklat (songon indikator H2O2) manang biru-ungu (songon indikator O2•−) na dihasilhon dievaluasi mamangke paket pengolahan gambar versi Fiji ImageJ (diakses 7 Maret 2024).
Malondialdehida (MDA; sebagai penanda peroksidasi lipid) ditontuhon mangihuthon metode ni Du dohot Bramlage (1992) dohot saotik parubahan. Daun sian ganup replika biologis (daun na gok berkembang paduahon dohot patoluhon sian ginjang) dipapungu 72 h pasca perawatan (hpt). Ganup replika biologis termasuk lima pot (dua suansuanan per pot). Ganup ulangan biologis dianalisis marganda (dua ulangan teknis) laho mamastihon ketepatan, keandalan dohot keterproduksi ni metode i. Singkatna, 0,5 g jaringan bulung tano dipangke laho ekstraksi MDA dohot asam triklorasetat 20% (TCA; Kandungan MDA di supernatan dung i ditontuhon secara kolorimetri marhite mangukur absorbansi di 532 dohot 600 nm mamangke spektrofotometer UV-160A (Perusahaan Shimadzu, Jepang) dung i dinyatakan songon nmol g−1 FW.
Tu penilaian antioksidan non enzimatik dohot enzimatik, dipungu ma bulung (bulung na gok berkembang paduahon dohot patoluhon sian ginjang) sian ganup ulangan biologis di 72 h pasca perawatan (hpt). Ganup replika biologis terdiri sian lima pot (dua suansuanan per pot). Ganup sampel biologis dianalisis marganda (dua sampel teknis). Dua bulung digiling dohot nitrogen cair jala dipangke langsung laho manontuhon antioksidan enzimatik dohot non-enzimatik, asam amino total, kandungan prolin, ekspresi gen, dohot pangukuran oksalat.
Total fenolik larut ditontuhon mamangke reagen Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. (1999). Singkatna, hira-hira 0,1 g jaringan bulung na homogen diekstraksi dohot 20 ml metanol 80% di na holom saleleng 24 h jala dipungu ma tadingna dung sentrifugasi. 0,1 ml ekstrak sampel dicampur dohot 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteu (10%), digoyang-goyang saleleng 30 s jala dipasombu di inganan na holom saleleng 5 min. Dung i, ditambai ma 0,5 ml larutan natrium karbonat 20% tu ganup tabung, dicampur ma denggan jala diinkubasi di suhu kamar di inganan na holom saleleng 1 j. Dung inkubasi, absorbansi campuran reaksi diukur di 765 nm mamangke spektrofotometer UV-160A (Perusahaan Shimadzu, Jepang). Konsentrasi total fenol larut di ekstrak sampel ditontuhon mamangke kurva kalibrasi asam galak (Fisher ilmiah, Hampton, NH, AS) jala dinyatakan songon miligram setara asam galak per gram berat segar (mg GAE g-1 berat segar).
Total kandungan flavonoid larut ditontuhon menurut metode Djeridane dkk. (2006) dohot saotik parubahan. Singkatna, 0,3 ml ekstrak metanol na di ginjang i dicampur dohot 0,3 ml larutan aluminium klorida 5% (AlCl3; Dicampur ma denggan jala diinkubasi di suhu kamar saleleng 30 min di na holom. Dung inkubasi, absorbansi campuran reaksi diukur di 430 nm mamangke spektrofotometer UV-160A (Perusahaan Shimadzu, Jepang). Konsentrasi total flavonoid larut di ekstrak sampel ditontuhon mamangke kurva kalibrasi rutin (TCI Amerika, Portland, OR, AS) dung i dipatuduhon songon miligram setara rutin per gram berat segar (mg RE g-1 berat segar).
Total kandungan asam amino bebas bulung ni kacang ditontuhon mamangke reagen ninhidrin na dimodifikasi (Bahan Kimia Ilmiah Termo, Waltham, MA, AS) marojahan tu metode na diusulhon ni Yokoyama dohot Hiramatsu (2003) jala dimodifikasi ni Sun dkk. (2006). Singkatna, 0,1 g jaringan tanah diekstraksi dohot penyangga pH 5,4, jala 200 μL sian supernatan direaksihon dohot 200 μL ninhidrin (2%) dohot 200 μL piridin (10%; diukur di 580 nm mamangke alat spektrofotometer UV-160A (Perusahaan Shimadzu, Jepang). Di sisi na asing, prolin ditontuhon marhite metode Bates (Bates dkk., 1973). Prolin diekstraksi dengan asam sulfosalisilat 3% (Bahan Kimia Termo Ilmiah, USA) dan setelah sentrifugasi, 0,5 ml supernatan dicampur dengan 1 ml asam asetat glasial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) dan reagen ninhidrin diukur pada suhu min0°C dan incu. di 520 nm mamangke spektrofotometer na sarupa songon na di ginjang i. Total asam amino bebas dohot prolin di ekstrak bulung ditontuhon mamangke kurva kalibrasi glisin dohot prolin (Sigma-Aldrich, St.
Laho manontuhon aktivitas enzimatik ni enzim antioksidan, hira-hira 500 mg jaringan homogen diekstraksi dohot 3 ml penyangga Tris 50 mM (pH 7,8) na marisi 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS), disentrifugasi di 10.000 × g saleleng 20 min di toru ni pendinginan (4 °C), jala dipapungu ma supernatan (ekstrak enzim kasar) (El-Nagar dkk., 2023; Osman dkk., 2023). Katalase (CAT) kemudian direaksikan dengan 2 ml penyangga natrium fosfat 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. 2023; Aktivitas enzimatik peroksidase (POX) na margantung tu guaiakol ditontuhon mamangke metode ni Harrach dkk. (2009). (2008) dohot parubahan na gelleng (El-Nagar dkk., 2023; Osman dkk., 2023) dohot aktivitas enzimatik polifenol oksidase (PPO) ditontuhon dung reaksi dohot 2,2 ml penyangga natrium fosfat 100 mM (pH 6,0l). 100 μl H2O2 12 mM. Metode i dimodifikasi saotik sian (El-Nagar dkk., 2023; Osman dkk., 2023). Assay dilakukan dung reaksi dohot 3 ml larutan katekol (0,01 M) na baru diparade di penyangga fosfat 0,1 M (pH 6,0). Aktivitas CAT diukur dengan memantau penguraian H2O2 di 240 nm (A240), aktivitas POX diukur dengan memantau peningkatan penyerapan di 436 nm (A436), dan aktivitas PPO diukur dengan mencatat fluktuasi penyerapan di 495 nm setiap min s u30 spektrofotometer (jepang).
RT-PCR waktu nyata dipangke laho mangalului tingkat transkrip ni tolu gen na marpardomuan tu antioksidan, tarmasuk katalase peroksisom (PvCAT1; Aksesi No KY195009.1), di bulung ni kacang (bulung na paduahon dohot patoluhon na gok berkembang sian ginjang) 72 h dung perawatan na parpudi. Singkatna, RNA diisolasi mamangke Kit Ekstraksi RNA Total Simply P (No. Dung i, disintesis ma cDNA mamangke Kit Sintesis cDNA TOP scriptTM hombar tu tudutudu ni pabrik. Urutan primer ni tolu gen na di ginjang i disurathon di Tabel Tambahan S3. Dipangke ma songon gen parrumah tangga jala ekspresi gen relatif dietong mamangke metode 2-ΔΔCT (Livak dohot Schmittgen, 2001). Stabilitas aktin di toru ni tekanan biotik (interaksi na so sadalan antara kacang-kacangan umum dohot jamur antraknosa) dohot tekanan abiotik (kemarau, keasinan, suhu na rendah) dipatuduhon (Borges dkk., 2012).
Di mulana, dibahen hami do analisis genom di siliko protein oksaloasetat asetilhidrolase (OAH) di S. Singkatna, hami mamangke OAH sian Aspergillus fijiensis CBS 313,89 (AfOAH; taksida: 1191702; nomor akses GenBank XP_040799428,1; 342 asam amino) dohot Penicillium lagena (PlOAH2; taksida1Bank nomor 9; 316 asam amino) songon urutan pangidoan laho mametahon protein na sarupa di S. BLASTp diulahon maralohon data genom S.
Dibahen ma muse analisis evolusi dohot pohon filogenetik ni AfOAH sian A. model (jones dkk., 1992). Pohon filogenetik dipasada dohot analisis penjajaran berganda urutan protein ni sude gen OAH na diprediksi (SsOAH) sian S. dohot si Agarwala, taon 2007). Di samping i, urutan asam amino na dumenggan na cocok sian SsOAH sian S. Alat ESP (versi 3.0;
Dung i, domain perwakilan fungsional na diprediksi dohot situs na dilestarihon SsOAH digoari secara interaktif tu keluarga na marasing mamangke alat InterPro (Blum dkk. Na parpudi, dibahen ma pemodelan struktur tolu dimensi (3D) ni SsOAH S. 2015) jala disahhon mamangke server SWISS-MODEL (Biasini dkk., 2014). Struktur tolu dimensi na diprediksi (format PDB) digambarkan secara interaktif mamangke paket UCSF-Kimera (versi 1.15;
Dipangke do PCR fluoresensi waktu nyata kuantitatif laho manontuhon tingkat transkripsi oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH; Singkatna, diinokulasihon ma S. Dung i, sel-sel i dirawat dohot L-ornitin dohot fungisida Rizolex-T di konsentrasi IC50 akhir (hira-hira 40 dohot 3,2 mg/L, masing-masing) dung i dibudidayahon saleleng 24 h nai di kondisi na sarupa. Dung inkubasi, kultur i disentrifugasi di 2500 rpm saleleng 5 min jala dipungu ma lipe (miselium jamur) laho dianalisis ekspresi gen. Songon i ma miselium jamur dipapungu di 0, 24, 48, 72, 96, dohot 120 h pasca infeksi sian suansuanan na terinfeksi naung membentuk jamur na bontar dohot miselium kapas di permukaan ni jaringan na terinfeksi. RNA diekstraksi sian miselium jamur dung i cDNA disintesis songon na digombarhon di ginjang. Urutan primer untuk SsOAH disurathon di Tabel Tambahan S3. Dipangke ma songon gen parrumah tangga, jala ekspresi gen relatif dietong mamangke metode 2-ΔΔCT (Livak dohot Schmittgen, 2001).
Asam oksalat ditontuhon di kaldu dekstrosa kentang (PDB) dohot sampel suansuanan na marisi patogen jamur Sclerotinia sclerotiorum mangihuthon metode Xu dohot Zhang (2000) dohot modifikasi saotik. Singkatna, isolasi S. Dung inkubasi, kultur jamur parjolo disaring marhite kertas saringan Whatman #1 dung i disentrifugasi 2500 rpm saleleng 5 min laho mambuat sisa miselium. Dipapungu ma supernatan jala disimpan di suhu 4°C laho manontuhon godang ni oksalat. Tu persiapan sampel suansuanan, hira-hira 0,1 g potongan jaringan suansuanan diekstraksi tolu hali dohot aek suling (2 ml ganup hali). Sampel i kemudian disentrifugasi dengan 2500 rpm selama 5 min, supernatan disaring kering melalui kertas saringan Whatman No.
Untuk analisis kuantitatif asam oksalat, campuran reaksi disiapkan dalam tabung bertutup kaca dengan urutan berikut: 0,2 ml sampel (atau filtrat kultur PDB atau larutan standar asam oksalat), 0,11 ml biru bromofenol (BPB, 1 mM), 0,176 ml kalium dikromat 100 mM (K2Cr2O7; bahan kimia TCI, Portland, OR, AS), dung i larutan i diencerkan dohot 4,8 ml di bagasan aek na 60 °C. Dung 10 min, reaksi i dihentikan marhite na manambai 0,5 ml larutan natrium hidroksida (NaOH; 0,75 M). Absorbansi (A600) campuran reaksi diukur di 600 nm mamangke spektrofotometer UV-160 (Perusahaan Shimadzu, Jepang). PDB dohot aek suling dipangke gabe kontrol laho mangukur saringan kultur dohot sampel suansuanan masing-masing. Konsentrasi asam oksalat di filtrat kultur, na dipatuduhon songon mikrogram asam oksalat per mililiter media PDB (μg.mL-1), dohot di ekstrak bulung, dipatuduhon songon mikrogram asam oksalat per gram berat segar (μg.g-1 FW), ditontuhon mamangke kalibrasi asam oksalat kurvasien, MA, Amerika Serikat).
I sapanjang panalitian, sude parcubaan irancang i desain na lengkap acak (CRD) dohot onom ulangan biologis per parlakuan dot lima pot ulangan biologis (dua suan-suanan per pot) kecuali ipaboa lain. Ulangan biologis dianalisis mardua hali (dua ulangan teknis). Ulangan teknis ipake giot mamareso keterproduksi tingon parcubaan na sarupa tai inda ipake i analisis statistik anso inda ulangan palsu. Data dianalisis secara statistik mamakke analisis varians (ANOVA) dilanjuthon dohot uji perbedaan signifikan jujur ​​(HSD) (p ≤ 0,05). Molo percobaan in vitro, nilai IC50 dohot IC99 dietong mamangke model probit jala selang kepercayaan 95% dietong.
Sebanyak opat isolasi dipapungu sian ladang kedelai na marasing di Kegubernuran El Ghabiya, Mesir. Di media PDA, sude isolasi manghasilhon miselium na bontar krem ​​na hatop marganti bontar kapas (Gambar 1A) dung i krem ​​manang coklat di tahap sklerotium. Sklerotia biasona padat, hitam, bola sanga inda maratur bentukna, ganjangna 5,2 sampe 7,7 mm dot diameterna 3,4 sampe 5,3 mm (Gambar 1B). Nang pe opat isolasi mengembangkan pola sklerotia marginal di pinggir media kultur dung 10-12 ari inkubasi di suhu 25 ± 2 °C (Gambar 1A), jumlah sklerotia per lempeng signifikan berbeda di antara mereka (P < 0,001), dengan isolasi tertinggi ha33a. 1,53 sklerotia per lempeng; Songon i ma nang isolasi #3 manghasilhon asam oksalat na gumodang di PDB sian isolasi na asing (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Gambar 1D). Isolasi #3 patuduhon ciri khas morfologis dohot mikroskopis ni jamur fitopatogen. Misalna, di PDA, koloni isolasi #3 hatop do tubu, marwarna bontar krem ​​(Gambar 1A), marbalik krem ​​manang kuning-coklat salmon na terang, jala porlu 6-7 ari di suhu 25 ± 2°C asa boi lengkap manutupi parmukaan ni piring na mardiameter 9 cm. Marhite ciri-ciri morfologi dohot mikroskopis na di ginjang i, ditanda ma isolasi #3 songon Sklerotinia Sklerotis.
Ciri-ciri dohot patogenitas ni isolasi S. (A) Pertumbuhan miselium opat isolasi S. sclerotiorum di media PDA, (B) sklerotia opat isolasi S. kultivar kacang-kacangan komersial na rentan Giza 3 di kondisi rumah kaca. Nilai mewakili rata-rata ± SD sian lima ulangan biologis (n = 5). Huruf na marasing patuduhon perbedaan na signifikan secara statistik antara perawatan (p < 0,05). (F-H) Gejala jamur putih khas muncul di batang dohot silika na di ginjang ni tano, masing-masing, 10 ari dung inokulasi dohot isolasi #3 (dpi). (I) Analisis evolusi wilayah spacer transkripsi internal (ITS) isolasi S. Angka na di ginjang ni garis-garis parpunguan patuduhon cakupan wilayah (%), jala angka na di toru ni garis-garis parpunguan patuduhon ganjang ni ranting.
Dung i, laho patoguhon patogenitas, opat isolasi S. Nang pe sude isolasi jamur na dapot i patogen jala boi menjangkiti kacang hijau (bdk. Giza 3), mambahen gejala jamur na bontar khas di sude bagian di ginjang ni tano (Gbr. 1F), tarlumobi di batang (Gbr. 1G) dohot polong (inokulasi) di 10. agresif isolasi di dua percobaan mandiri. Isolasi 3 do na tumimbo parah ni sahit (%) di suansuanan kacang (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, dohot 76,7 ± 3,1 di 7, 14, dohot 21 ari dung infeksi; Gambar 1F).
1I. Analisis filogenetik antara isolasi #3 dohot 20 isolasi/galur acuan patuduhon kesamaan na timbo (>99%) di nasida. Siparrohahonon do, isolasi S. OR206374,1; 548 bp), na mambahen busuk batang ni bunga ungu (Matthiola incana), sude i dikelompokkan secara terpisah di punsu ni dendrogram (Gambar 1I). Urutan na imbaru i nunga disimpan di basis data NCBI jala dibahen goarna “Sklerotinia sklerotiorum – isolasi YN-25” (nomor aksesi GenBank PV202792). Boi do idaon isolasi 3 i ma isolasi na paling invasif; ala ni i, isolasi on dipillit laho diparsiajari di sude percobaan na mangihut.
12,5, 25, 50, 75, 100 dohot 125 mg/l) tu isolasi S. Siparrohahonon do, L-ornitin marpanghorhon antibakteri jala lam leleng mangambati pertumbuhan radial ni hifa S. Di konsentrasi na tumimbo na diuji (125 mg/L), L-ornitin patuduhon tingkat penghambatan pertumbuhan miselium na tumimbo (99,62 ± 0,27%; Gambar 2B), na sarupa dohot fungisida komersial Rizolex-T na diuji) (tingkat penghambatan tertinggi 99,49% Gambar 2B; (10 mg/L), na patuduhon sarupa do khasiatna.
Aktivitas antibakteri L-ornitin di bagasan vitro maradophon Sklerotinia. (A) Perbandingan aktifitas antibakteri ni konsentrasi L-ornitin na marasing tu S. (B, C) Tingkat penghambatan (%) pertumbuhan miselium S. Nilai mewakili rata-rata ± SD sian lima ulangan biologis (n = 5). Huruf na marasing patuduhon perbedaan statistik antar perawatan (p < 0,05). (D, E) Analisis regresi model probit L-ornitin dohot fungisida komersial Rizolex-T, masing-masing. Garis regresi model probit dipatuduhon songon garis biru padat, jala selang kepercayaan (95%) dipatuduhon songon garis merah putus-putus.
Asing ni i, dibahen do analisis regresi probit jala dipatuduhon do plot na hombar tusi di Tabel 1 dohot Gambar 2D,E. Singkatna, nilai kemiringan na boi dijalo (y = 2,92x − 4,67) dohot statistik na signifikan na mardomu tusi (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 dan p < 0,0001; (y = 1,96x − 0,99, R2 = 0,1242, R2 = 0,1708 dan p <0,0001) (Tabel 1).
Nilai konsentrasi penghambat setengah maksimal (IC50) dohot 99 (mg/l) L-ornitin dohot fungisida komersial “Rizolex-T” maradophon S.
Secara keseluruhan, L-ornitin (250 mg/L) marlapatan mangurangi perkembangan dohot parah ni jamur na bontar di suansuanan kacang umum na dirawat dibandinghon suansuanan na so dirawat na terinfeksi S. Singkatna, nang pe parah ni sahit ni suansuanan kontrol na terinfeksi na so diobati lam leleng lam tamba (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, dohot 92,33 ± 3,06%), L-ornitin secara signifikan mangurangi parah ni sahit (%) saleleng percobaan (8,0 ± 0,5). 1,00, dohot 26,36 ± 3,07) di 7, 14, dohot 21 ari dung perawatan (dpt), masing-masing (Gambar 3A). Songon i ma nang suansuanan kacang na hona S. 183,61 ± 7,71; Gambar 3B). Tren na sarupa do na diida di percobaan paduahon.
Panghorhon ni penerapan eksogen L-ornitin tu perkembangan busuk putih ni kacang biasa na dibahen Sclerotinia sclerotiorum di kondisi rumah kaca. (A) Kurva perkembangan sahit cetakan putih kacang biasa dung dirawat dohot L-ornitin 250 mg/L. (B) Luas di toru ni kurva perkembangan sahit (AUDPC) jamur putih kacang biasa dung dirawat dohot L-ornitin. Nilai mewakili rata-rata ± SD sian lima ulangan biologis (n = 5). Huruf na marasing patuduhon perbedaan na signifikan secara statistik antar perawatan (p < 0,05).
Aplikasi eksogen L-ornitin 250 mg/L lam leleng lam tamba ma timbo ni suansuanan (Gbr. 4A), godang ni ranting per suansuanan (Gbr. 4B), dohot godang ni bulung per suansuanan (Gbr. 4C) dung 42 ari. Di tingki i, adong do panghorhon na umbalga tu sude parameter gizi na diparsiajari, alai panghorhon na umbalga do paduahon dibandinghon tu kontrol na so dirawat (Gambar 4A-C). Di sisi na asing, perlakuan L-ornitin ndang adong pengaruh na signifikan tu kandungan pigmen fotosintesis klorofil a (Gbr. 4D) dohot klorofil b (Gbr. 4E), alai saotik do tamba kandungan karotenoid total (0,56 ± 0,03 mg/g wt) dibandinghon tu kontrol negatif (0. 4F). Secara keseluruhan, hasil on patuduhon molo L-ornitin ndang fitotoksik tu kacang-kacangan na dirawat jala boi do bahkan merangsang pertumbuhanna.
Panghorhon ni pangkeon ni L-ornitin eksogen tu ciri pertumbuhan dohot pigmen fotosintesis ni bulung ni kacang na hona Sclerotinia sclerotiorum di kondisi rumah kaca. (A) Timbo ni suansuanan (cm), (B) Godang ni ranting di sada suansuanan, (C) Godang ni bulung di sada suansuanan, (D) Kandungan klorofil a (mg g-1 fr berat), (E) Kandungan klorofil b (mg g-1 fr berat), (F) Total kandungan karotenoid (mg g-1 fr). Nilai ima rata-rata ± SD sian lima ulangan biologis (n = 5). Huruf na marasing patuduhon perbedaan na signifikan secara statistik antara perawatan (p < 0,05).
Lokalisasi histokimia in situ spesies oksigen reaktif (ROS; dinyatakan sebagai hidrogen peroksida [H2O2]) dohot radikal bebas (dinyatakan sebagai anion superoksida [O2•−]) mangungkaphon bahwa aplikasi eksogen L-ornitin (250 mg/L) secara signifikan mengurangi akumulasi H2. 5A) dohot O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Gambar 5B) dibandinghon tu akumulasi ni dua suansuanan na terinfeksi na so dirawat (173,31 ± 12,06 dohot 149,35 ± 7,94 nmol respektif dohot W. 170,12 ± 9,50 dan 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr berat, masing-masing) di 72 h. Timbo ni H2O2 dohot O2•− na marpungu di toru ni hpt (Gbr. 5A, B). Songon i ma, uji malondialdehida (MDA) berbasis TCA patuduhon, suansuanan kacang na hona S. Alai, pangkeon ni L-ornitin secara eksogen mambahen lam moru peroksidasi lipid songon na dibuktihon marhite penurunan kandungan MDA di suansuanan na dirawat (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Panghorhon ni aplikasi L-ornitin eksogen tu penanda utama stres oksidatif dohot mekanisme pertahanan antioksidan non-enzimatik di bulung ni kacang na hona S. (A) Hidrogen peroksida (H2O2; nmol g-1 FW) pada 72 hpt, (B) anion superoksida (O2•-; nmol g-1 FW) pada 72 hpt, (C) malondialdehida (MDA; (E) jumlah flavonoid larut (mg RE g-1 FW) di 72 hp, (F) jumlah asam amino bebas (mg g-1 fw) di 72 hp, dohot (G) kandungan prolin (mg g-1 fw) di 72 hp. Nilai mewakili rata-rata ± simpang baku (rata-rata ± SD) sian 5 ulangan biologis (n = 5). Huruf na marasing patuduhon perbedaan na signifikan secara statistik antara perawatan (p < 0,05).