Panyortiran protein i jalur sekresi porlu tu manjago kompartemen sel dot homeostasis. Salain panyortiran na imediasi cangkang, peran lipid i panyortiran kinesin i proses transportasi sekresi ima sada parsoalan dasar na madung lolot na inda dialusi dope. Dison, hami patupahon pencitraan waktu nyata resolusi tinggi multiwarna serentak 3D laho mambuktihon di vivo na baru disintesis glikosilfosfatidilinositol-protein na diimobilisasi dohot bagian lipid seramida na mansai ganjang dikelompokkan jala digoari gabe endoplasma khusus Protein khusus na marasing sian situs keluaran transmembram na. Asing ni i, tapatuduhon do na ganjang ni rante ni seramida di selaput retikulum endoplasma mansai ringkot tu selektifitas penyortiran on. Studi nami mangalehen bukti langsung langsung i vivo parjolo giot mangklasifikasikon kargo protein mardasarkon ganjang rantai lipid manjadi situs ekspor selektif i jalur sekresi.
Di sel eukariotik, protein na disintesis di retikulum endoplasma (ER) dungni dipillit tingki diboan marhite jalur sekresi laho dipasahat tu tujuan sel na pas (1). Salain penyortiran na dimediasi mantel, nunga leleng disangkapi molo lipid na tontu boi do muse gabe titik kaluar selektif marhite na mangalompokkon i tu domain membran na tartontu na protein na tartontu (2-5). Tai, adong dope na hurang bukti langsung di vivo laho mambuktihon mekanisme na marbasis lipid na mungkin on. Laho pasaehon masalah dasar on, hami mamparsiajari di ragi songon dia protein berlabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI-AP) diekspor secara berbeda sian ER. GPI-AP ima ragam ni protein permukaan sel na mardomu tu lipid ( 6, 7 ). GPI-AP ima protein na disekresihon na menempel tu bulung-bulung luar selaput plasma lewat bagian glikolipid (jangkar GPI). Dijalo nasida do jangkar GPI songon parubahan pasca-terjemahan na konservatif di lumen ER (8). Dung dipasang, GPI-AP mamolus sian alat Golgi (5, 9) sian ER tu selaput plasma. Hadirion ni jangkar GPI mambahen GPI-AP diboan marsirang sian protein na disekresihon sian selaput (termasuk protein selaput plasma na asing) di sepanjang jalur sekresi (5, 9, 10). Di sel ragi, GPI-AP dipisahkan sian protein na asing na disekresihon di retikulum endoplasma, dung i dibungkus gabe vesikel na unik na dibungkus marhite kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Penentu proses klasifikasi on i proses ekspor ER inda jelas, tai i spekulasikon molo mekanisme on bisa porlu lipid, tarlobi-lobi pemodelan struktural bagian lipid jangkar GPI (5, 8). Di ragi, remodeling lipid GPI pintor dimulai dung GPI menempel, jala di godang kasus, i mambahen seramida mangikat tu asam lemak jenuh rantai panjang 26 karbon (C26:0) (11, 12). C26 seramida ima seramida utama na ihasilkon sel ragi salolotna. Disintesis do i di ER jala godangan do i diekspor tu aparat Golgi marhite vesikel COPII (13). 14, 15), jala di giliranna, konversi seramida gabe inositol fosfat keramida (IPC) di aparat Golgi margantung tu sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika dohot selaput buatan madung patuduhon molo seramida rantai asil na mansai ganjang boi mardomu laho mambahen domain na taratur dohot sifat fisik na unik (17, 18). Data on mambaen hipotesis molo seramida C26 dot GPI-AP dohot seramida C26 mamake sifat fisikna giot mardomu manjadi daerah na taratur sanga daerah i lingkungan lipid membran ER na relatif kacau. Tarlumobi terdiri sian gliserolipid na jempek dohot na so jenuh (C16:1 dohot C18:1) (19, 20). Daerah-daerah on akan selektif difokuskan tu situs keluar ER (ERES) tertentu, di dia seramida dohot GPI-AP berbasis seramida boi rap diboan tu Golgi di vesikel COPII na sarupa na dikhusushon (5).
Di penelitian on, hami nunga langsung manguji mekanisme berbasis lipid on marhite mamangke mikroskop pencitraan waktu nyata konfokal resolusi super (SCLIM), i ma teknik mikroskop mutlak na boi sekaligus mangamati protein na marlabel neon. (21, 22).
Parjolo sahali, dibahen hami ma teknologi SCLIM laho patoranghon songon dia GPI-AP na normal dohot kelompok seramida C26 disaring sian protein na disekresihon sian selaput dung kaluar sian ER di S. Di bagasan na laho mamareso klasifikasi ni ER, dipangke hami ma sistem genetik na boi langsung mambahen gambaran ni kargo na baru disintesis masuk tu ERES secara vivo (7, 23). Songon muatan, hami mamillit C26 berbasis keramida GPI-AP Gas1 na ditanda dohot protein neon hijau (GFP) dohot protein na disekresihon transmembran Mid2 na ditanda dohot protein neon inframerah na jonok (iRFP), na dua i martujuan tu selaput plasma (24-26). Di mutan peka suhu sec31-1, dua muatan on dinyatakan di toru ni promotor na boi diinduksi galaktosa dohot penanda ERES na mambahen. Di suhu ekstrim (37°C), ala mutasi sec31-1 mempengaruhi fungsi komponen lapisan COPII Sec31 laho mangambati perkecambahan COPII dohot ekspor ER, kargo na baru disintesis marpungu di ER (23). Dung ngali tu suhu na rendah (24°C), sel mutan sec31-1 malum sian daerah sekresi, jala muatan sintetis na baru na marpungu mulai diekspor sian ER. Visualisasi CLIM patuduhon, godangan Gas1-GFP dohot Mid2-iRFP na baru disintesis tong dope marpungu di ER ni sel mutan sec31-1 dung diinkubasi di suhu 37°C dung i dipalua di suhu 24°C saleleng 5 menit (Gambar 1). Ala Mid2-iRFP marserak di sandok selaput ER, jala Gas1-GFP marpusat jala marpungu di luat selaput ER na so marsirang, gabe marasing situtu do parserahan ni nasida (Gambar 1, A sahat tu C dohot Film S1). Asing ni i, songon na di gambar 1D, gugus Gas1-GFP ndang adong Mid2-iRFP. Hasil on patuduhon, GPI-AP dohot protein translaput dipisah tu daerah selaput ER na marasing di mulana. 1, E dohot F, dohot film S1) (23) na marlabel dohot protein lapisan COPII ni mCherry.
Sec31-1 sel mengekspresikan sekresi induksi galaktosa, rantai asil panjang (C26) keramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dohot protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) jala pelabelan ERES Konstruktif on dibahen di magenta di menit, dipindahon tu 24°C, jala digambarkan SCLIM 5 menit dungkon i. (A sahat tu C) patuduhon gambar 2D na digabung manang tunggal na mewakili bidang (A), gambar proyeksi 2D sian 10 bagian z (B) manang gambar belahan sel 3D sian kargo dohot penanda ERES (C). Skala batang 1μm (A dohot B). Satuan skala ima 0,551μm (C). Gas1-GFP diida di daerah manang kelompok ER na terpisah, sementara Mid2-iRFP diida jala dibagihon tu sude selaput ER (C). (D) Grafik patuduhon intensitas pendar relatif ni Gas1-GFP dohot Mid2-iRFP di gugus Gas1-GFP di sepanjang garis panah na bontar (hambirang). AU, satuan sewenang-wenang. (E dohot F) manggombarhon gambar 3D na padomuhon barang dohot tanda ERES. Gas1-GFP gugusan dideteksi jonok tu ERES na khusus. Satuan skala ima 0,551μm. (F) Panah padat na bontar mananda gugus Gas1-GFP na mardomu tu ERES. Panel partonga dohot siamun patuduhon gambar 3D na dipabalga na digabung dohot tampilan na diputar sian gugus Gas1-GFP na dipillit.
Hubungan spasial na donok antara gugus Gas1-GFP dohot ERES tartontu patuduhon molo Gas1-GFP boi masuk tu ERES selektif, na marasing sian selektifitas na dipangke Mid2-iRFP laho maninggalhon ER. Laho mangadopi kemungkinan on, diukur hami ma rasio ERES holan tu sada manang dua barang (Gambar 2, A sahat tu C). Didapot hami do, godangan ERES (70%) holan sada do jenis ni muatan. Gambar na di toru ni Gambar 2C patuduhon dua contoh khas ERES na holan Gas1-GFP (Gambar 1) manang holan Mid2-iRFP (Gambar 2). Sebalikna, hira-hira 20% ERES marisi dua muatan na tumpang tindih di sada luat. Didapot do adong ERES (10%) na marisi dua jenis muatan, alai diisolasi do i di luat na tangkas marasing. Alani i, analisis statistik on patuduhon dung diekspor ER, GPI-AP Gas1-GFP dohot kargo transmembran Mid2-iRFP dibagi gabe ERES na marasing (Gambar 2D). Efisiensi penyortiran on mansai sadalan do tu analisis biokimia na salpu (6) dohot penentuan morfologis (7). Boi do muse tapamanat pangalaho ni muatan na dikarantina masuk tu ERES (Gambar 2E dohot Film S2). Gambar 2E patuduhon holan saotik do Gas1-GFP (panel 3) manang Mid2-iRFP (panel 4) na masuk tu ERES sian sada sisi jala terbatas di luat na terpisah. Panel 5 sian Gambar 2E patuduhon, Gas1-GFP dohot Mid2-iRFP sipata jumpang di ERES na sarupa, alai masuk sian sisi na marasing jala marpusat di luat na marasing na boi mewakili vesikel COPII na marasing. Dipaboa hami do muse, na patuduhon pangalaho na sarupa tu Mid2-iRFP. (Gambar S1 dohot Film S3). Axl2-GFP na baru disintesis dibagihon marhite membran ER songon Mid2-iRFP (Gambar S1, A dan B), jala bersama-sama berlokasi dohot Mid2-iRFP di sebagian besar ERES (Gambar S1, B sahat tu D). Panel 1 dohot 2 sian Gambar 1. S1C patuduhon dua contoh khas ERES di na dua muatan transmembran tumpang tindih. Di angka kasus on, rap masuk do duansa barang i tu ERES (Gambar S1E, Panel 3 dohot Film S3).
Dung diinkubasi sekresi na boi dibahen galaktosa, dibahen ma sekresi i tu suhu 30 menit. blok, jala gambar dohot SCLIM dung 20 menit. (A sahat tu C) Gambar proyeksi 2D perwakilan (A; batang skala, 1 μm) manang gambar belahan sel 3D (B dohot C; satuan skala, 0,456 μm) ni muatan dohot 10 bagian z na ditanda ERES. Panel na di toru di (B) dohot panel di (C) pataridahon gambar na diolah laho pataridahon holan barang na adong di ERES (abu-abu) dohot Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah terbuka: ERES holan mamboan sada muatan (1 sahat tu 4). Panah abu-abu: ERES marisi muatan na dipisah (5). Panah padat na bontar: ERES na marisi muatan na marlokasi bersama. Di toru on: ERES tunggal na dipillit holan marisi Gas1-GFP (1) manang Mid2-iRFP (2). Batang skala, 100 nm. (D) Pangukuran ni fotomikrograf na digombarhon di (C). Rata-rata persentase ERES na marisi holan sada muatan (Gas1-GFP manang Mid2-iRFP), muatan na terpisah dohot muatan na tumpang tindih. Di tolu percobaan mandiri, n=432 di 54 sel. Bar hasalaan = SD. Uji t na so marpasangan dua ekor. *** P = 0,0002 do i. (E) Gambar 3D ERES na dipillit sian muatan na dikarantina na ditanda dohot (C). Gas1-GFP (hijau) (3) manang Mid2-iRFP (biru) (4) masuk tu ERES (merah) sian sada sisi jala dibatasi tu luat na metmet di bagasan ERES. Sipata, duansa jenis muatan i masuk tu ERES na sarupa (5) sian sisi na sarupa jala terbatas tu sada luat na terpencil di bagasan ERES i. Batang skala, 100 nm.
Dung i, diuji hami ma sada hipotesis na mandok, keramida rantai asil na ganjang (C26) na adong di selaput ER i do na manogunogu pengelompokan dohot penyortiran Gas1 na khusus gabe ERES na selektif. Laho mangulahon on, dipangke hami ma galur ragi na dimodifikasi GhLag1, di na dua sintase seramida endogen Lag1 dohot Lac1 digantihon tu GhLag1 (homolog Lag1 ni kapas), na manghorhon galur ragi na marlaput sel galur keramida na jempek sian tipe liar (Gambar 3A) (2). Analisis spektrometri massa (MS) patuduhon molo di galur tipe liar, 95% sian total keramida mansai ganjang (C26) rantai keramida, sementara di GhLag1, 85% sian keramida mansai ganjang (C18 dohot C16). ), holan 2% do keramida na mansai ganjang (C26) rantai keramida. Nang pe seramida C18 dohot C16 ima seramida utama na dideteksi di selaput GhLag1 saleleng on, analisis MS pe patoguhon na jangkar GPI ni Gas1-GFP na diekspresihon di galur GhLag1 mengandung seramida C26, na sebanding dohot lipid tipe liar. Sarupa do kualitasna (Gbr. 3A) (26). Alani i, on marlapatan do i enzim remodeling seramida Cwh43 sangat selektif tu seramida C26, songon na dipatuduhon di Gambar 26, ibana lebih memilih memasukkan jangkar GPI sian saotik seramida C26 di galur GhLag1. S2 (29). Nang pe songon i, selaput sel ni GhLag1 dasarna holan marisi seramida C18-C16, sementara Gas1-GFP tong do marisi seramida C26. Fakta on mambaen galur on manjadi alat na ideal giot sacara khusus menyelesaikan masalah ganjang rantai asil seramida membran i ER. Peran hipotetis ni kelas dohot penyortiran. Dung i, parjolo ma hami mamparsiajari kemampuan ni C26 Gas1-GFP laho marpungu di rumpun di GhLag1 dohot alel mutan peka suhu sec31-1 marhite mikroskop pendar konvensional, di na holan rantai na ganjang (C18-C16) na adong di membran ER Keramida (Gambar 3). Dipamanat hami do di sek31-1, godangan Gas1-GFP dipusatkan di rumpun, sementara Gas1-GFP di sek31-1 GhLag1 na ganjang (C18-C16) ganjang selaput ER keramida terutama ndang marrumpun jala tersebar di Di sude selaput ER. Molo naeng tepat, ala C26 berbasis keramida penggumpulan erat hubunganna tu ERES tertentu (Gambar 1), hami selanjutna menyelidiki manang na proses on boi do tong melibatkan fungsi ni mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP mamakke sistem khusus COPII tu ekspor ER, na aktif diatur marhite renovasi struktural Ted1 tu bagian glikan jangkar GPI (30, 31). GPI-glikan rekombinan i kemudian itandai oleh kompleks p24 reseptor kargo transmembran, na i giliranna selektif merekrut Lst1, ima isoform khusus tingon subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, mambaen Vesikel COPII na kayo GPI-AP i porlu (31). Alani i, dibahen hami ma mutan ganda na padomuhon penghapusan ni protein tunggal on (komponen kompleks p24 Emp24, enzim pemodelan ulang GPI-glikan Ted1 dohot subunit COPII khusus Lst1) dohot galur mutan sec31-1, jala diparsiajari hami ma nasida Boi do membentuk gas GFP1-c3). Dipamanat hami do di sek31-1emp24Δ dohot sek31-1ted1Δ, Gas1-GFP terutama ndang marpungu jala tersebar di sude membran ER, songon na hea taida di sek31-1 GhLag1, sementara di sek31-1lst1Δ, Gas1-G1 Songon sek3. Hasil on patuduhon, salain adong ni seramida C26 di membran ER, parpunguan ni Gas1-GFP pe porlu do mangikat tu kompleks p24, jala ndang porlu rekrutmen Lst1 na khusus. Dung i, disulingkiti hami ma kemungkinan ganjang ni rante keramida di selaput ER boi mangatur ikatan Gas1-GFP tu p24. Alai, dapot hami do hadirion ni seramida C18-C16 di membran ndang manghorhon tu GPI-glikan na dibahen muse kompleks p24 (Gambar S3 dohot S4, A dohot B) manang na mangikat tu GPI-AP dohot na mangekspor GPI-AP. hagogoon. Rekrut COPII subtipe Lst1 (Gambar S4C). Alani i, parpunguan na margantung tu seramida C26 ndang porlu interaksi protein dohot mekanisme ekspor protein ER na marasing, alai mendukung mekanisme penyortiran alternatif na didorong ganjang ni lipid. Dung i, dianalisis hami ma manang na ringkot do ganjang ni rantai asil keramida di selaput ER tu klasifikasi na efektif ni Gas1-GFP songon ERES selektif. Ala Gas1 di galur GhLag1 na marrantai pendek kaluar sian ER jala masuk tu selaput plasma (Gambar S5), porsea do hami molo penyortiran i diboan ganjang ni rantai asil keramida, Gas1 di galur GhLag1 boi diarahhon jala dibolus. Barang ERES dohot selaput na sarupa.
(A) Membran sel GhLag1 terutama mengandung seramida C18-C16 na jempek, sementara jangkar GPI Gas1-GFP tong do adong IPC C26 na sarupa songon sel tipe liar. Di ginjang: analisis ganjang rantai asil seramida di selaput sel tipe liar (Wt) dohot galur GhLag1p marhite spektrometri massa (MS). Data i manggombarhon persentase ni sude keramida. Rata-rata tolu percobaan mandiri. Bar hasalaan = SD. Uji t na so marpasangan dua ekor. **** P <0,0001. Panel bawah: Analisis MS panjang rantai asil IPC hadir di jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) na dinyatakan di galur tipe liar dohot GhLag1p. Data i manggombarhon persentase sian total sinyal IPC. Rata-rata lima percobaan mandiri. Bar hasalaan = SD. Uji t na so marpasangan dua ekor. ns, ndang ringkot. P = 0,9134 do. (B) Mikrograf fluoresensi sel-sel na mengekspresikan Gas1-GFP na diinduksi galaktosa di inkubasi di suhu 37 ° C saleleng rutinitas mikroskop. dung 24°C. Panah putih: Gugus Gas1-GFP ER. Panah terbuka: Gas1-GFP na so marpungu dibagihon di sude selaput ER, patuduhon pewarnaan cincin inti na khas ER. Batang skala, 5 m. (C) Pangukuran ni fotomikrograf na digombarhon di (B). Rata-rata persentase sel na marstruktur Gas1-GFP na martitik. Di tolu percobaan mandiri, n≥300 sel. Bar hasalaan = SD. Uji t na so marpasangan dua ekor. **** P <0,0001.
Laho langsung pasaehon parsoalan on, dibahen hami ma visualisasi SCLIM ni Gas1-GFP dohot Mid2-iRFP di GhLag1 dohot alel mutan peka suhu sec31-1 (Gambar 4 dohot Film S4). Dung ER ditahan di suhu 37°C jala diuduti dipalua di suhu 24°C, godangan Gas1-GFP na baru disintesis ndang marpungu jala marserak di sandok membran ER, songon na diida marhite mikroskop konvensional (Gambar 4, A dohot B ). Asing ni i, godang do persentase ni ERES (67%) na tarmasuk dua jenis muatan na bersamaan di bagasanna (Gambar 4D). Panel 1 dohot 2 sian Gambar 4C patuduhon dua contoh khas ERES na tumpang tindih Gas1-GFP dohot Mid2-GFP. Asing ni i, duansa barang i direkrut tu ERES na sarupa (Gambar 4E, panel 3 dohot film S4). Alani i, hasilnami patuduhon na ganjang ni rantai asil seramida di selaput ER i ma penentu na ringkot di agregasi dohot klasifikasi protein ER.
Sel-sel GhLag1 na patuduhon sekresi na dibahen galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dohot Mid2-iRFP (TMP, biru) dohot sel-sel na marlabel ERES (ERES, magenta) na marlabel ERES (ERES, magenta) Diinkubasi di suhu 37°C. Torus ma saleleng 30 menit, turun ma tu 24°C asa kaluar sekresi, jala gambarhon ma dohot SCLIM dung 20 menit. (A sahat tu C) Gambar proyeksi 2D perwakilan (A; batang skala, 1 μm) manang gambar belahan sel 3D (B dohot C; satuan skala, 0,45 μm) sian 10 bagian z na ditanda marhite muatan dohot ERES. Panel na di toru di (B) dohot panel di (C) pataridahon gambar na diolah laho pataridahon holan barang na adong di ERES (abu-abu) dohot Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah na diisi putih: ERES, barang tumpang tindih. Buka panah: ERES marisi holan sada barang. Panel toru: ERES na dipillit adong barang tumpang tindih (1 dohot 2) na ditanda di (C). Batang skala, 100 nm. (D) Pangukuran ni fotomikrograf na digombarhon di (C). Di unit GhLag1 sek31-1 dohot sek31-1, holan sada do muatan (Gas1-GFP manang Mid2-iRFP) na dipamasuk, jala rata-rata persentase ERES tu muatan na terisolasi dohot muatan na tumpang tindih. Di tolu percobaan mandiri, n = 432 di 54 sel (sec31-1) dohot n = 430 di 47 sel (sec31-1 GhLag1). Bar hasalaan = SD. Uji t na so marpasangan dua ekor. *** P = 0,0002 (detik31-1) dohot ** P = 0,0031 (detik31-1 detik1). (E) Gambar 3D ERES na dipillit dohot muatan tumpang tindih (3) na ditanda di (C). Gas1-GFP (hijau) dohot Mid2-iRFP (biru) mandapothon ERES (magenta) sian sisi na sarupa jala tinggal di daerah terbatas ERES na sarupa. Batang skala, 100 nm.
Studi on mangalehen bukti langsung i vivo molo kargo protein na marbasis lipid igolongkan manjadi situs ekspor selektif i jalur sekresi, dot mangungkapkon pontingna ganjang rantai asil tu selektifitas klasifikasi. Dipangke hami do teknik mikroskopi na marhuaso jala na mutlak na digoari SCLIM, dipatudu hami do Gas1-GFP na baru disintesis (sada selaput plasma utama GPI-AP na mansai ganjang rantai asil (C26) porsi lipid keramida) di ragi ) selaput ER (Gambar 1). Asing ni i, dua jenis barang on masuk tu ERES na marasing secara selektif (Gambar 2). Ganjang ni rantai asil seramida seluler di membran diorui sian C26 gabe C18-C16, gugus Gas1-GFP terganggu tu daerah ER na diskrit, jala Gas1-GFP dialihon muse laho maninggalhon ER dohot protein transmembran marhite ERES na sarupa (Gambar 3 dohot Gambar 3). 4).
Nang pe GPI-AP mamangke mekanisme protein khusus laho kaluar sian ER, dapot hami do pamisahan na margantung tu seramida C26 ndang mangasahon interaksi protein na marasing na boi mambahen spesialisasi ERES (Gambar S4 dohot S5). Gariada tahe, dapotnami mendukung mekanisme klasifikasi alternatif na diboan marhite punguan protein na marbasis lipid dohot pengecualian na mangihut sian muatan na asing. Pangamatan nami patuduhon, wilayah manang gugus Gas1-GFP na marpardomuan tu ERES na tertentu hurang do protein na disekresihon sian selaput Mid2-iRFP, na patuduhon na gugus GPI-AP na margantung tu seramida C26 i mambahen lam mura nasida masuk tu ERES na mardomu tusi, jala di tingki na sarupa, ndang tarmasuk tu ERES na khusus on. 2). I balik ni i, hadirion ni seramida C18-C16 i selaput ER inda mambaen GPI-AP mambaen daerah sanga gugus, jadi inda mangasingkon sanga manggantikon protein na isekresihon tu ERES na sarupa (Gambar 3 dot 4). . Alani i, huusulhon hami ma asa seramida C26 manogunogu pamisahan dohot klasifikasi marhite na mangurupi parpunguan ni protein na mardomu tu ERES na khusus.
Boha do asa boi dapot kelompok C26 na bergantung tu seramida on gabe sada daerah ER tertentu? Kecenderungan seramida membran marpisah tu samping bisa mambaen seramida GPI-AP dot C26 mambaen lipid na menek dot seketika marurut i lingkungan lipid na lobi inda taratur tingon membran ER na marisi gliserolipid na lobi pendek dot inda jenuh. Rumpun na marmutu (17, 18). Gugus sementara na metmet on boi do lam mardomu gabe gugus na umbalga jala na stabil dung mangikat tu kompleks p24 (34). Sadalan tu i, hami patuduhon na C26 Gas1-GFP porlu marsaor dohot kompleks p24 laho membentuk gugusan na tarida na umbalga (Gambar 3). Kompleks p24 ima oligomer heterozigot na tardiri sian opat protein transmembran p24 na marasing di ragi (35), na mangalehon ikatan multivalen, na boi manghorhon tu paikat silang ni gugus GPI-AP na metmet, marhite i manghasilhon gugus Stabil na umbalga (34). Interaksi antara ektodomain protein ni GPI-AP pe boi do mambahen agregasi nasida, songon na dipatuduhon tingki pengangkutan Golgi nasida di sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Alai, molo adong keramida C18-C16 di selaput ER, molo kompleks p24 mangikat tu Gas1-GFP, ndang terbentuk be gugusan na balga na marsirang. Mekanisme na mendasari bisa margantung tu sifat fisik dot kimia khusus tingon seramida rantai asil na ganjang. Studi biofisika membran buatan patuduhon, nang pe keramida rantai asil na ganjang (C24) dohot na jempek (C18-C16) boi mambahen pemisahan fase, holan seramida rantai asil na ganjang (C24) do na boi mambahen Lengkungan na timbo dohot lengkungan film laho mambahen film i gabe ulang. Marhite na masiurupan (17, 37, 38). Dipatuduhon do na heliks transmembran ni TMED2, homolog ni jolma ni Emp24, marsaor secara selektif dohot sfingomilin berbasis seramida C18 di lobus sitoplasma (39). Dipangke hami ma simulasi dinamika molekuler (MD), dapot hami ma keramida C18 dohot C26 marpungu di humaliang ni lobus sitoplasma ni heliks transmembran Emp24, jala sarupa do lomo ni rohana (Gambar S6). Siparrohahonon do, on patuduhon na heliks transmembran ni Emp24 boi mambahen asimetris parserahan lipid di selaput. On ma hasil na baru-baru on na marojahan tu sel mamalia. Simulasi MD na sarupa pe patuduhon hadirion ni lipid eter (40) . Alani i, marsangka do hami molo seramida C26 di dua lobus ni ER26 i diperkaya secara lokal. Molo GPI-AP di lobus luminal langsung mengikat tu p24 multivalen dohot akumulasi seramida C26 di sekitar p24 di lobus sitoplasma, boi do i mendorong agregasi Protein na mandongani jala kelengkungan membran dihasilhon marhite jari-jari (41), mambahen GPI-AP marsirang gabe daerah na timbo, daerah ni selaput ER (42). Laporan na salpu mendukung mekanisme na diusulhon (43, 44). Dibahen ma tu selaput plasma na balga, mambahen lam godang parsirangan ni fasa jala mambahen selaput i gabe muba jala gabe internalisasi (44). (43) Didapot do molo adong rantai asil na ganjang (C24) alai ndang jempek (C16), ligan kovalen na tarihot tu laktosilseramida GSL mambahen tubu angka gugusan na balga dohot invaginasi membran, jala transduksi sinyal na dimediasi sitoplasma Lyn marhite chagitropil di bulung-bulung i ma interduksi.
Di sel epitel terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-golgi (TGN) tu tingkat selaput plasma apikal mangatur pemisahan dohot penyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi on didongani oligomerisasi GPI-AP (36), alai boi do i margantung tu ganjang ni rantai keramida na dapot hita di ragi. Nang pe GPI-AP ni mamalia adong jangkar na marbasis lipid eter, jala struktur kimiana mansai marasing sian seramida rantai asil na mansai ganjang, sada penelitian na baru-baru on mandapotkon na dua lipid i adong sifat fisik dohot kimia na sarupa secara evolusi Dohot fungsi (40). Alani i, bagian lipid eter di sel mamalia boi do sarupa dohot seramida C26 di ragi, jala peranna marsaor dohot seramida rantai panjang di selaput laho mambahen agregasi dohot panyortiran GPI-AP. Bope kemungkinan on porlu dope iuji sacara langsung, temuan nasolpu mandukung molo pangangkutan seramida rantai asil na ganjang tu badan Golgi inda ilaksanaon protein pamindahan sitoplasma, tai margantung tu sintesis jangkar GPI songon ragi. Alani i, mekanisme konservatif evolusi songon na boi selektif rap mangangkut keramida rantai asil na mansai ganjang dohot GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) di bagasan vesikel pengangkutan na sarupa.
I sistem sel epitel terpolarisasi ragi dot mamalia, agregasi GPI-AP dot pamisahan tingon protein selaput plasma lainna sude tarjadi i jolo sampe tu parmukaan sel. Paladino dkk. (48) mandapot molo di TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, pengelompokan GPI-AP ndang holan porlu tu klasifikasi selektif GPI-AP tu selaput plasma apikal, alai dohot do mangatur organisasi pengelompokan GPI-AP dohot Aktivitas biologisna. Permukaan sel do. Di ragi, penelitian on patuduhon, gugus GPI-AP na margantung tu seramida C26 di ER boi mangatur organisasi gugus dohot ulaon fungsi GPI-AP di selaput plasma (24, 49). Sadalan tu model on, sel GhLag1 alergi tu penghambat GPI manang obat na mempengaruhi integritas dinding sel (28), jala kebutuhan tu gugusan Gas1-GFP fungsional (49) sian seramida ujung na diproyeksihon di parkawinan sel ragi patuduhon G Kemungkinan konsekuensi fisiologis sel hLag1. Hasalaan ni GPI-AP. Alai, pangujian na dumenggan manang na organisasi fungsional ni parmukaan sel nunga diprogram sian ER marhite metode penyortiran na marojahan tu ganjang ni lipid gabe subjek penelitianta tu joloan on.
Galur Sakaromises na dipangke di ulaon on disurathon di Tabel S1. 1583 dohot MMY1635 galur SCLIM untuk pencitraan sel hidup dibangun di latar belakang W303. Galur on na mengekspresikan Sec13-mCerry dohot tanda protein neon dibangun mamangke metode berbasis reaksi berantai polimerase (PCR) dohot plasmid pFA6a songon cetakan (23). Galur na mengekspresikan Mid2-iRFP na dicap dohot protein neon na dikuasai promotor GAL1 dibangun songon on. 64687; Dung diperkuat urutan genom Mid2-iRFP dohot dikloning tu promotor GAL1, dipasada ma i tu situs Not I-Sac I sian plasmid pRS306. Plasmid pRGS7 na dihasilhon digariskan dohot Pst I asa boi mardomu tu lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP diekspresihon di toru ni kendali ni promotor GAL1 di plasmid sentromer (CEN), na dibangun songon on. Urutan Gas1-GFP diperkuat marhite PCR sian plasmid pRS416-GFP (hadiah sian L. Popolo) jala dikloning tu situs Xma I-Xho I sian plasmid CEN pbevy-gl leu2 (hadiah sian C) . Tulang; Plasmid tambahan nomor 51225; 51225; RRID: Tambahan_51225). Plasmid na dapot i dibahen ma goarna pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP pe diekspresihon di toru ni kendali ni promotor GAL1 ni vektor LEU2 pBEVY-GL, jala konstruksi na songon on. Urutan Axl2-GFP diperkuat sian plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) marhite PCR, jala dikloning tu situs Bam HI-Pst I ni vektor LEU2 pBEVY-GL. Plasmid na dapot i dibahen ma goarna pRGS12. Urutan ni oligonukleotida na dipangke di penelitian on disurathon di Tabel S2.
Galur i ditambahi dohot 0,2% adenin dohot 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% rafinosa [YP-rafinosa] kaya ekstrak ragi protein p (YP) media (1 % ekstrak ragi dohot 2% protein ept). (YPR)] manang 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] songon sumber karbon, manang di media minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi dohot 0,5% amonium sulfat) laho manambai asam amino dohot basa na pas na dihaporluhon tu gizi , Jala mengandung 2% glukosa sintetis minimal2 (media minimal galaktosa sintetis) songon sumber karbon.
Dipaboa ma di media YPR di suhu 24 ° C saborngin sahat tu fase log parsitongaan. Dung induksi di YPG di suhu 24°C saleleng 1 jom, sel-sel i diinkubasi di SG di suhu 37°C saleleng 30 menit, dung i dipindahon tu 24°C asa dipalua sian blok sekresi. Dipangke ma konkanavalin A laho padengganhon sel-sel i di slide kaca jala digambarkan marhite SCLIM. 100 × 1,4 lensa minyak bukaan numerik (Olympus), kecepatan tinggi dohot rasio sinyal-tu-suara na timbo, pemindai intensif cakram putar (Yokogawa Electric) dohot sistem khusus. (Fotonik Hamamatsu) boi mangalehon sistem lensa pembesar dohot pembesaran akhir ×266,7 dohot kamera alat na marmuatan na marganda elektron (Fotonik Hamamatsu) (21). Pengambilan gambar dilakukan dengan perangkat lunak khusus (Yokogawa Listrik). Molo gambar 3D, hami mamakke aktuator piezolistrik na dibahen khusus laho manggetar lensa objektif secara vertikal, jala papunguhon bagian optik na marjarak 100 nm di sada tumpukan. Gambar tumpukan Z diubah gabe data voxel 3D, jala fungsi penyebaran titik teoritis na dipangke tu mikroskop konfokal cakram na marputar dipangke tu pemrosesan dekonvolusi marhite perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Marhite na mamangke perangkat lunak Volosity asa otomatis ambang batas tu analisis ko-lokasi, ERES termasuk muatan diukur. Analisis pindai garis diulahon mamangke perangkat lunak MetaMorph (Perangkat Molekuler).
Pake ma perangkat lunak Prisma Graphpad laho manontuhon signifikansi statistik. Molo uji t Siswa dua ekor dohot uji analisis varians satu arah (ANOVA) biasa, perbedaan antar kelompok dianggap berdampak signifikan tu P <0,05 (*).
Di mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log ditumbuhi saborngin di YPD jala dipungu marhite sentrifugasi, dicuci dua hali dohot garam penyangga fosfat, jala diinkubasi di atas es saotikna 15 menit, dung i dilanjuthon di toru ni mikroskop songon na digombarhon di jolo (Periksa24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 oil PH3 CS) na dilengkapi dohot lensa objektif, saringan L5 (GFP), kamera Hamamatsu dohot perangkat lunak Application Suite X (LAS X) dipangke laho mangalap. .
Sampel i didenaturasi dohot penyangga sampel SDS di suhu 65 ° C saleleng 10 menit, dung i dipisahkon marhite elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (HALAMAN). Untuk analisis imunoblot, 10 μl sampel dimuat per jalur. Antibodi primer: Pake anti-Gas1 poliklonal kelinci di pengenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci di pengenceran 1:500, dohot anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah sian H. Antibodi monoklonal anti-Pgk1 tikus dipangke di pengenceran 1:5000 (hadiah sian J. Antibodi sekunder: IgG anti kelinci kambing konjugasi lobak peroksidase (HRP) na dipangke di pengenceran 1:3000 (Pierce). IgG anti tikus kambing na dikonjugasi HRP dipangke di pengenceran 1:3000 (Tusuk). Zona tanggapan kekebalan diperhatikan dengan metode kemiluminesen reagen Pico Barat SuperSignal (Ilmiah Termo Fisher).
Songon na digombarhon di (31), dibahen ma percobaan imunopresipitasi alami tu fraksi ER na diperkaya. Singkatna, cuci ma sel ragi dohot penyangga TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonilfluorida dan campuran penghambat protease) di 600 nm ( OD600) di 100 hali optik. Diponggolhon ma i marhite manik-manik kaca, dung i dibuat ma angka ramuan sel dohot manik-manik kaca i marhite sentrifugasi. Dung i, dibahen ma 17.000 g saleleng 15 menit di suhu 4°C. Pelet i disuspensi ulang di TNE jala ditambahhon saponin digitalis sahat tu konsentrasi akhir 1%. Suspensi i diinkubasi saleleng 1 jom dohot rotasi di suhu 4°C, dung i komponen na so larut dipadao marhite sentrifugasi di 13.000 g di suhu 4°C saleleng 60 menit. Molo di imunopresipitasi Gas1-GFP, parjolo ma pra-inkubasi sampel i dohot manik-manik agarose kosong (ChromoTek) di suhu 4°C saleleng 1 jom, dung i diinkubasi ma dohot GFP-Trap_A (ChromoTek) di suhu 4°C saleleng 3 jom. Manik-manik na diendapkan lima hali dohot TNE na mengandung digoksigenin 0,2%, dielusi dohot penyangga sampel SDS, dipisahkan di SDS-HALAMAN, jala dianalisis marhite imunoblotting.
Songon na digombarhon di (31), penentuan penghubung silang diulahon tu fraksi ER na diperkaya. Singkatna, fraksi ER na diperkaya i diinkubasi dohot ditiobis 0,5 mM (suksinimidil propionat) Reaksi pengikat silang dipadamhon marhite na manambai glisin (konsentrasi akhir 50 mM, 5 menit, 20°C).
Songon naung digombarhon nangkin (50), dibahen ma analisis MS seramida di galur tipe liar dohot GhLag1. Singkatna, sel-sel i ditumbuhhon tu fase eksponensial (3 sahat tu 4 unit OD600/ml) di YPD di suhu 30°C, jala 25×107 sel dipanen. Metabolisme ni nasida dipamate marhite asam triklorasetat. Dipangke ma pelarut ekstraksi [etanol, aek, eter, piridin dohot amonium hidroksida 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] dohot 1,2 nmol kualitas keramida C17 standar internal (860517, lipid kutub Avanti). Pake ma reagen monometilamin [metanol, aek, larutan n-butanol dohot metilamin (4:3:1:5 v/v)] laho patupahon hidrolisis basa ringan ni ekstrak i, dung i pake ma n-butanol na jenuh aek laho mangamburhon garam. Ujungna, ekstrak i disuspensi muse di bagasan pelarut mode positif [kloroform/metanol/aek (2:7:1) + amonium asetat 5 mM] jala disuntikhon tu spektrometer massa. Dibahen ma pemantauan multi reaksi (MRM) laho mananda dohot mangukur molekul sfingolipid. Dilengkapi do dohot sumber ion aliran nano robot nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) laho analisis lipid. Energi tabrakan dioptimalhon tu ganup kategori keramida. Data MS didapot di mode positif. I tiap ulangan biologis, sinyal lipid ima median tingon tolu pangukuran mandiri.
Songon na digombarhon di (31), sel-sel (800×107) na pataridahon Gas1-GFP dibahen tu imunopresipitasi alami. Gas1-GFP na dimurnihon i dipisah marhite SDS-HALAMAN jala dipindahon tu selaput poliviniliden fluorida (PVDF). Protein i digambarkan marhite pewarnaan PVDF dohot amida hitam. Pita Gas1-GFP dipotong sian PVDF jala dicuci 5 hali dohot metanol jala sahali dohot aek kelas cair-MS (LC-MS). Dengan menginkubasi strip membran dengan 500 μl NaOAc 0,3 M (pH 4,0), penyangga dan 500 μl campuran natrium nitrit 1 M na baru dilarutkan di suhu 37°C saleleng 3 jom, fraksi lipid dipalua sian Gas1-GFP dohot inofasin dilisis Pelepasan inosamin (51). Dung i, strip membran i dicuci opat hali dohot aek kelas LC-MS, dikeringkan di suhu kamar, jala disimpan di suasana nitrogen di -80°C sahat tu na dianalisa. Songon kontrol, sampel kosong sian selaput PVDF dipangke tu ganup percobaan. Lipid na diekstraksi sian Gas1-GFP dung i dianalisa marhite MS songon na digombarhon (50). Singkatna, strip PVDF na marisi GPI-lipid disuspensi ulang di pelarut cetakan negatif 75 μl [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] jala lulus ionisasi elektrosemprot (ESI)-Analisis MRM/MS spesies sfingolipid (TSQ Vantage). Di bagasan on, data MS didapot di mode ion negatif.
Songon na nidok nangkin, bagian lipid ni jangkar GPI dipisah sian GPI-AP na marlabel [3H]-inositol (16). Lipid i dipisah dohot kromatografi lapisan tipis mamakke sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) jala digambarkan mamakke FLA-7000 (Fujifilm).
Sel-sel na mengekspresikan Gas1-GFP (600×107) dicuci dua hali dohot penyangga TNE dohot penyangga TNE, jala diponggolhon dohot manik-manik kaca, dung i disentrifugasi laho mambuat puing-puing sel dohot manik-manik kaca. Dung i, disentrifugasi ma 17.000 g saleleng 1 jom di suhu 4°C. Pelet i dicuci di TNE jala diinkubasi dohot 1 U PI-PLC (Invitrogen) di TNE na mengandung digitalis saponin 0,2% saleleng 1 jam di suhu 37°C. Dung dibahen perlakuan enzim, dibuat ma membran i marhite sentrifugasi 17.000 g di suhu 4°C saleleng 1 jom. Laho mangalononghon Gas1-GFP, diinkubasi ma supernatan i dohot GFP-Jebakan_A (ChromoTek) di suhu 4°C saborngin. Gas1-GFP na dimurnihon na dipisahkan marhite SDS-HALAMAN diwarnai dohot warna biru cemerlang Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP dipotong sian abu-abu na humaliang akuaduk, dung i dung alkilasi dohot yodoasetamida dohot reduksi dohot ditiotreitol, pencernaan dalam gel dohot tripsin diulahon. Ekstrak dohot kering peptida triptik dohot peptida dohot GPI-glikan. Peptida na kering i dilarutkan di 20 μl aek. Suntik ma sada porsi (8μl) tu LC. 150 mm × 1,0 mm; Nomura Kimia, Prefektur Aichi, Jepang) dipangke laho mamisahkon peptida di kondisi gradien na tertentu. Fase bergerak ima pelarut A (0,08% asam formik) dohot pelarut B (0,15% asam forfat di 80% asetonitril). Dipangke ma sistem HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) laho mangelusi kolom i dohot pelarut A di bagasan 55 menit dohot laju aliran 50 μl min-1 saleleng 5 menit, dung i ditambai ma konsentrasi pelarut B gabe 40%. , Amerika Serikat). Eluat torus dipamasuk tu sumber ion ESI, jala peptida triptik dohot peptida na marglikan GPI dianalisis marhite LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa jebakan ion linier hibrida; Di pengaturan MS, tegangan sumber kapiler diatur tu 4,5 kV, jala suhu ni kapiler transfer dijaga 300°C. Tegangan kapiler dohot tegangan lensa tabung diatur tu 15 V dohot 50 V. Data MS/MS didapot di mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagian per juta) di rentang massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. disosiasi na dibahen tabrakan (DIS)].
Simulasi MD dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GROMACS (52) dohot medan gaya Martini 2 (53-55). Dung i, dipangke ma Pembangun Membran GUI CHARMM (56, 57) laho mambahen lapisan ganda na marisi dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) dohot Cer C18 manang DOPC dohot Cer C26. Topologi dohot koordinat Cer C26 dibuat sian DXCE marhite na mambuat manik-manik ekstra sian ihur ni sfingosin. Pake ma proses na digombarhon di toru on laho menyeimbangkan lapisan ganda jala mardalan, dung i pake ma koordinat terakhir ni sistem i laho mambangun sistem na marisi Emp24. 173 sahat tu 193) dibangun songon heliks α mamangke alat visual MD (VMD) struktur molekuler (58). Dung i, dung dipadao lipid na martindih, dibahen ma protein i kasar jala dipamasuk tu lapisan ganda mamangke GUI CHARMM. Sistem na parpudi marisi 1202 DOPC dohot 302 Cer C26 manang 1197 DOPC dohot 295 Cer C18 dohot Emp24. Ionhon ma sistem i sahat tu konsentrasi 0,150M. Opat ulangan mandiri dibahen tu dua komposisi lapisan ganda.
Lapisan ganda lipid iimbangi mamake proses GUI CHARMM, na mangalibatkon meminimalkon dot dungni mangimbangi 405.000 langkah, i dia kendala posisi martahap ikurangi dot ihilangkan, dot langkah waktu itambahon tingon 0,005 ps manjadi 0,02 ps. Dung seimbang, ia manghasilkon 6 μs dohot langkah waktu 0,02 ps. Dung dipamasuk Emp24, pangke ma proses GUI CHARMM na sarupa laho meminimalkan dohot menyeimbangkan sistem, dung i mardalan ma saleleng 8 s di produksi.
Anggo sude sistem, i maso proses penyeimbangan, tekanan i kendalikon barostat Berendsen (59), dot i maso proses produksi, tekanan i kendalikon barostat Parrinello-Rahman (60). I sude kasus, tekanan rata-rata ima 1 bar dot skema kopling tekanan semi isotropik ipake. Di proses keseimbangan dohot produksi, dipangke ma termostat (61) dohot kalibrasi ulang kecepatan laho padomuhon suhu ni partikel protein, lipid dohot pelarut masing-masing. Di sandok operasi i, suhu na ditujuhon 310K. Interaksi non-ikatan iparetongkon dohot mambaen daftar pasangan mamake skema Verlet dohot toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb iparetongkon mamake medan reaksi dot jarak potong 1,1 nm. Istilah Vander Waals mamake skema potong dohot jarak potong 1,1 nm, dot skema potong Verlet ipake tu potensi hanyut (62).
Make VMD, ganjang gelombang pamotongan antara manik-manik fosfat DOPC sanga manik-manik keramida AM1 dohot protein ima 0,7 nm, dot bahat lipid na marinteraksi dohot protein i iparetongkon. Mangihuthon rumus na mangihut, etong ma faktor habis-pengayaan (DE) songon na di (63): Faktor DE = (godang ni lipid na adong di protein 0,7) di protein 0,7 (godang ni Cer di total lipid) .
Nilai na dilapothon dapot songon rata-rata, jala bilah kesalahan ima opat salinan mandiri sian SE. Signifikansi statistik faktor DE dietong marhite uji t [(rata-rata faktorDE-1)/SE]. Etong ma nilai P sian parbagian na sada ekor.
Alat GROMACS dipangke laho mangetong peta kepadatan samping 2D ni sistem na marisi Emp24 di bagasan 250 ns terakhir ni jejak. Asa dapot peta pengayaan/penghabisan seramida, peta kepadatan Cer dibagi dohot jumlah peta Cer dohot DOPC, dung i dibagi dohot konsentrasi Cer di pamatang. Skala peta warna na sarupa do na dipangke.
Molo naeng mandapot bahan tambahan tu artikel on, ida ma di http://www.
On ma sada artikel akses terbuka na dibagihon di toru ni ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, na mangizinhon pangkeon, distribusi dohot reproduksi di media aha pe, asal ma pangkeon akhirna ndang tu keuntungan komersial jala premisna ima molo karya aslina tingkos. Bona.
Catatan: Holan mangido do hami asa dilehon hamu alamat emailmuna asa diboto halak na disaranhon hamu tu halaman i na lomo rohamuna mangida email i jala ndang spam. Ndang na laho manangkap hami alamat email.
Sungkunsungkun on dipangke laho manguji molo hamu pengunjung jala mangambati pengajuan spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan waktu nyata 3D resolusi tinggi mangungkaphon ringkot ni ganjang ni rantai keramida tu penyortiran protein di situs keluaran selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan waktu nyata 3D resolusi tinggi mangungkaphon ringkot ni ganjang ni rantai keramida tu penyortiran protein di situs keluaran selektif.
©2020 Punguan Amerika tu Kemajuan Ilmu Pengetahuan. sude hak dijaga. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, CrossRef dan COUNTER. 2375-2548.