Mauliate ma ala dikunjungi hamu Nature.com.
Dang songon vertebrata, serangga godang dianggap hurang hormon steroid seks na bias tu baoa. Perkembangan telur dohot kawin ima sifat-sifat reproduksi na ringkot, mangantusi songon dia nyamuk Anopheles boruboru mengintegrasikan sinyal hormonal on boi mempermudah desain program pengendalian malaria na baru. 3D20E, na mangalinggomi natoras marhite na manutup reseptivitas seksual ni borua mangihuthon transfer seksual dohot aktivasi marhite defosforilasi. 20E na marharoroan sian boruboru ndang mambahen tanggapan seksual, alai boi do martolor dung dihambat kinase na mangambati 20E. keberhasilan reproduksi ni nyamuk na manularhon malaria.
Kasus dohot hamatean malaria lam tamba muse4 ala ni ketahanan insektisida na lam rarat di nyamuk Anopheles, sada-sadana vektor ni parasit malaria ni jolma. mambahen peristiwa kawin tunggal on gabe steril, balga do potensina laho mangurangi godang ni nyamuk di lapangan.
Borua gabe cacat seksual dung manjalo hormon steroid titer tinggi sian baoa.Studi patuduhon, pemicu hamaolon di parkawinan selanjutna ima 20-hidroksiekdison (20E), sada hormon steroid na umgodang ditanda songon pengatur siklus molting di tahap larva secara khusus tu E. Spesies Anopheles na gabe bagian sian subgenus Cellia7, na tarsebar di Afrika jala tarmasuk vektor malaria na paling berbahaya, termasuk Anopheles gambiae. di na boruboru mangintegrasihon sinyal sian dua sumber ekdison na marasing (transfer baoa dohot induksi mangan mudar) so pola mangambati kemampuanna sandiri laho marjodohan.
Sada hatorangan na mungkin ima molo A. gambiae jantan papindahon ekdison spesifik jantan na dimodifikasi, na mangaktifhon kaskade sinyal di saluran kekawinan boruboru, na manghorhon tu ketidakstabilan parkawinan. steroid ndang ditanda di angka serangga.
Dibahen hami ma laho manontuhon repertoar ni hormon steroid di kelenjar aksesoris jantan (MAG) ni A. di jaringan on, na patoguhon hasil na salpu.Alai, sampel i didominasi steroid fosforilasi na teroksidasi, na sadalan tu rumus 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Gambar 1). (20E22P).Intensitas sinyal HPLC-MS/MS ni 3D20E22P dua hali tumimbo sian bentukna na defosforilasi, 3D20E, jala tolu hali tumimbo sian E dohot 20E (Gambar 1). 1a).Laos dianalisa hami do ekdisteroid di baoa dohot boruboru na baru ditutup (<1 ari umurna) jala holan di MAG do diida hami 3D20E dohot 3D20E22P; E, 20E dohot 20E22P adong di kedua jenis kelamin (Data Perpanjangan Gambar 1b).Data on mandok, jantan dewasa A.
MAG dohot LRT boruboru (termasuk atrium, vesikel mani, dohot parovarium) dibedah sian jantan na marhasohotan na marumur 4 ari (4 ari) dohot boruboru na marhasohotan dohot na marhasohotan (0,5, 3, dohot 12 hpm). tingkat penemuan (FDR) dikoreksi; NS, ndang signifikan; *P < 0,01 . 3D20E22P: 3 jam vs 0,5 jam, P = 0,25; 12 jam vs 3 jam, P = 0,0032; nyamuk.Ekdison digombarhon marhite warna songon on: E, hijau; 20E, warna oranye; 20E22P, na ungu; 3D20E, warna biru; 3D20E22P, warna pink.Inset i manambai skala di sumbu y laho patuduhon tingkat ekdison na tumoru.
Laho manyalidiki manang na 3D20E22P dohot 3D20E dipindahon tingki kawin, hami mambedah LRT boruboru di berbagai titik waktu dung kawin. Manggunahon 3D20E na disintesis secara kimia songon standar, ditontuhon hami do na tingkat hormon steroid on di LRT kawin saotikna 100 hali lipat tumimbo sian 20E (Tabel Data Perpanjangan 1). LRT boruboru tingki kawin, jala bentukna na defosforilasi, 3D20E, gabe mansai godang ndang sadia leleng dung kawin.On manunjukkon peran na ringkot tu ekdison na parpudi di biologi pasca kawin boruboru.
2a, mamangke pipa bioinformatika na dibahen khusus, dilului hami ma ekdison kinase (EcK), ekdison oksidase (EO), dohot ekdison na mangkodehon calon fosfatase na diekspresihon 20E. Gen EPP dohot dua gen EcK na marpotensi (EcK1 dohot EcK2), alai ndang boi jumpang calon gen EO na denggan. jaringan boruboru on. diparhatopot mamangke antibodi na khusus (Gbr. 2d).
a, Sada pipa bioinformatika na dibahen khusus laho mangalului jaringan reproduksi ni ganup jenis kelamin laho mangalului gen na mangkode EcK, EO, dohot EPP.Angka na di lambung ni panah patuduhon godang ni calon baoa dohot borua di ganup langkah. jantan, dohot sada gen EcK (EcK2) na diekspresihon di kedua jenis kelamin alai ndang manghasilhon calon gen EO.b, Peta panas membandingkan ekspresi gen calon di jaringan perawan (V) dohot kawin (M) Anopheles gambiae dohot Anopheles albicans.Spca, pembuahan; MAG, kelenjar aksesoris di baoa; bagian-bagian ni pamatang na asing, tarmasuk payudara, habong, pat, pamatang na mokmok, dohot organ-organ dalam di kedua jenis kelamin, dohot ovarium di borua. hpm, patuduhon 67 protein na paling godang.Boru-boru dipagodang-godang di panganon na marisi 15N laho mambahen label (dohot manggohi) sude protein.Jantan na so ditanda dipasangkan dohot boru-boru na martanda, jala LRT boru-boru dibedah di 3, 12 dohot 24 hpm laho analisis daftar tambahan proteomik untuk Tabel 1). d, EPP diida marhite western blot di MAG dohot LRT ni boruboru na marjodohan, alai ndang di boruboru na so marhasohotan manang baoa manang sisa ni boruboru na so marhasohotan. antibodi anti-EPP.Sude baoa na so marhasohotan.Ida ma Gambar Tambahan 1 laho mandapot data sumber gel.Dibahen ma blot barat dua hali jala sarupa do hasilna.
2a. Dung i, tingki dipahohom hami EPP marhite gangguan reproduksi na dimediasi RNA (RNAi), diida hami do pangurangan na gogo sian mafata di (Gambar 3a), jala boruboru na mardongan saripe dohot baoa na dihohomhon EPP patuduhon na signifikan A proporsi na umtoru sian 3D20E na defosforilasi (Gambar 3b) nang pe dihohomhon gen parsial (Data Perpanjangan Gambar 2b, c). mandok, enzim i do na khusus tu 3D20E22P (Gbr. 3b).
a, Penurunan aktivitas fosfatase di MAG disebabkan oleh pembungkaman EPP menggunakan kontrol RNA EPP untai ganda (dsEPP) atau RNA GFP untai ganda (dsGFP). dipasangan dohot jantan na dihohomhon EPP adong do proporsi 3D20E na defosforilasi na marlapatan umtoru di 3 hpm (P = 0,0043, uji t na so marpasangan, dua sisi), sedangkan tingkat 20E ndang terpengaruh (P = 0,063, na so marpasangan). t-uji, dua sisi).Data dipasahat songon rata-rata ± sem sian tolu kolam 13, 16 dohot 19 boru-boru masing-masing.c, Boru-boru na marjodohan dohot baoa na dihohomhon EPP memiliki tingkat perkawinan ulang na signifikan tumimbo (P = 0,0002, uji tepat Fisher memastikan boru-boru nasida parjolo tu dua sisi). 2 ari dungkon i, dihubungi ma nasida dohot baoa na asing na mamboan sperma transgenik laho menilai tingkat kawin ulang marhite deteksi PCR kuantitatif ni transgen i. 0,088, uji Mann-Whitney, dua sisi) , sementara tingkat perkawinan ndang terpengaruh (P = 0,94, uji eksak Fisher, dua sisi).Di sude panel, n manggombarhon godang ni sampel nyamuk na mandiri secara biologis.NS, ndang signifikan. P < 0,001.
Dung i, dievaluasi hami ma manang na ringkot do defosforilasi ekdison laho manginduksi resistensi kawin di boruboru. kesuburan (Gbr. 3d, kiri) dohot saotik penurunan jumlah tolor na dibahen boruboru on (Gbr. 3d, tengah), sementara persentase tolor na dibahen boruboru (respon na asing na dihasilhon di boruboru marhite kawin )) ndang terpengaruh (Gbr. 3d, kanan on). mandok, aktivasi ni 3D20E marhite EPP na dipindahon tingki parkawinan boi do marperan na ringkot laho mamatehon reseptivitas ni borua tu parkawinan na dumenggan, sada pangalaho na jolo dianggap tu pindahan seksual ni 20E .
4a-c) na disintesis secara kimia dohot 20E na adong di pasar. (Gbr. 4d).Na tarbarita, satonga tingkat fisiologis 3D20E di LRT (1.066 pg pasca suntikan vs. konsentrasi na tumimbo 18 hlm dung marhasohotan; Hasil on sadalan do tu gagasan na mandok, perpindahan seksual ni 20E ndang mambahen masa refrakteris kawin, jala selanjutna manunjuk tu 3D20E songon faktor utama laho memastikan hubungan orang tua-anak. tingkat bertelur normal na huparrohahon hami dung dibungkahon EPP parsial ala adong sisa aktivitas 3D20E na tong dihasilhon faktor borua na dipicu Kawin.
(a,b) 3D20E disintesis secara kimia sian 20E (a) dohot konversi/efisiensi na mansai timbo (data dipasahat songon rata-rata ± sem sian tolu reaksi sintesis mandiri) (b).c. 0,02;0,21 μg, P <0,0001; uji tepat Fisher, dua sisi) dohot 10% etanol (0,63 μg, P <0,0001; 0,21 μg, P <0,0001; uji kontrol Fisher lebih tinggi dari 0,0001; dosis na tumimbo (0,63 μg, P = 0,0002; 0,21 μg, P = 0,54; uji eksak Fisher, 2 sisi). 0,13 μg, P = 0,0003; uji eksak Fisher, dua sisi), sementara 20E dibandingkan kontrol Holan di dosis na tumimbo (0,21 μg, P = 0,022; 0,0019; 0,13 μg, P = 0,075; uji eksak Fisher, dua sisi).Di sude panel, n manggombarhon godang ni sampel nyamuk na mandiri secara biologis. ***P < 0,001, ****P < 0,001.Data ima sian tolu ulangan.
Di angka penelitian na salpu, ditontuhon hami do molo perpindahan seksual ni hormon steroid mambahen ekspresi MISO (Perangsang Oogenesis 11), sada gen reproduksi boruboru na mangalinggomi A. 3D20E manang 20E na dia do na mambahen ekspresi ni gen on. Jadi, perpindahan seksual ni hormon steroid androgenik on tarida mambahen mekanisme na mangalinggomi borua sian biaya na dibahen infeksi parasit na marasing. E reseptor EcR, menginduksi EcR-A dan menekan EcR-B, dan lebih kuat memicu gen-gen induksi kawin na asing, termasuk HPX15, na mempengaruhi kesuburan wanita. dihalomohon diaktifhon dua hormon ekdison na boi mendasari fungsi khusus jenis kelamin.
Dung i, diuji hami ma fungsi ni dua gen EcK na ditanda di pipa bioinformatika nami. 2b, c dohot Tabel Tambahan 2), hami mangsahhon aktivitas kinase ekdisteroid na marhite na mangikubasi dohot 20E, na manghorhon fosforilasi 20E22P (Data Perpanjangan Gambar 2). 4c), na mandok, 20E sian 3D20E do na boi gabe sasaran na dihalomohon ni EcK2.
Mangihuthon analisis RNA-seq nami, EcK2 pe mansai diekspresihon di LRT ni boru-boru na so marhasohotan, di na dipamate dung marhasohotan (Gbr. 2b). 20E22P erat hubunganna tu puncak 20E (22-26 jam dung mangan mudar; Data Perpanjangan Gambar 5b). 5d,e), selanjutna menunjukkan bahwa produksi 20E ni borua ndang manginduksi periode refrakteris kawin na martamba tu boruboru. 5f).Molo suntikan RNA Eck2 untai ganda (dsEcK2) diulahon dung dilehon mangan mudar, ndang masa perkawinan, di titik i ma puncak 20E ala ni panganon mudar nunga turun hasil pendukung on. alai holan molo blok pemijahan (EcK2 dohot mungkin faktor na asing) dipamate marhite kawin. cukup laho manginduksi ketidaknyamanan kawin, alai efektif dipicu titer na timbo sian 3D20E na dipindahon secara seksual.
Hasil nami mangalehon wawasan na ringkot tu mekanisme na mangatur keberhasilan reproduksi ni A. 3D20E di borua mangalusi perpindahan seksual ni EPP khusus baoa.Sahat tu na taboto, on ma contoh na parjolo sian sistem hormon steroid na didominasi baoa dohot borua na mangulahon fungsi na unik jala kritis di serangga. Hipotesis 18 ima molo fungsi-fungsi on boi diulahon marhite prekursor 20E E1. kaskade na dikendalihon 3D20E di A. gambiae ina-ina dohot laho manontuhon manang na boi do kaskade on dilestarihon antara nyamuk dohot Drosophila.
Dilehon peran na ringkot ni 3D20E tu kesuburan dohot pangalaho ni borua na ditanda di penelitiannami, jalur na mangarahon tu sintesis dohot aktivasi 3D20E menawarkan kesempatan na baru tu strategi pengendalian nyamuk tu joloan on, songon generasi ni jantan na marsaing di strategi teknologi serangga na mandul di U3. Fungsi khusus ni baoa ni 3D20E boi do markembang tingki A. gambiae dohot spesies Cellia na asing mandapot kemampuan laho papunguhon manina gabe colokan kawin, ala on mambahen boi denggan papindahon godang ni hormon dohot enzim na mangaktifhon hormon. (marhite ekspresi na timbo sian MISO) laho manghalomohon kebugaran reproduksi nasida di luat na timbo prevalensi malaria, na secara tidak langsung mambahen penularan Plasmodium. saonari aspek kunci ni interaksi nyamuk-parasit.
A. nyamuk dilehon mangan ad libitum larutan dekstrosa 10% dohot mudar ni jolma ganup minggu (komponen mudar studi).
Percobaan kawin paksa dilakukan sesuai protokol yang digambarkan sebelumnya.Tu kawin alami, boru-boru na marbaju na marumur 4 ari dijaga di rasio 1:3 dohot baoa na marbaju na dewasa secara seksual saleleng dua borngin.Untuk percobaan dimana jantan disuntik dengan dsEPP, fotofaktivitas bersama di maksimal dihohomhon (Data Perpanjangan Gambar 2b).
Jaringan nyamuk, sisa bangke (sisa ni pamatang), manang sude pamatang dibedah gabe 100% metanol jala dihomogenhon marhite manik (manik kaca 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik).Jumlah jaringan dohot volume metanol songon on: sisa ni pamatang1,0 μ0. MAG, 50-100 80 l; μl.Endapan dilakukan ekstraksi metanol kedua dengan volume metanol yang sama.Puing-puing sel dipadao dengan sentrifugasi.Metanol dari kedua ekstraksi digabungkan dan dikeringkan di bawah aliran nitrogen, kemudian disuspensi kembali dalam volume wa 8 berikut: 50 m; MAG dohot LRT borua, 30 μl.
μl sampel disuntikkan ke kolom 3 μm, 100 × 4,6 mm. (aek, asam formik 0,1%) dohot B (asetonitril, asam formik 0,1%).Gradien LC songon on ma: 5% B saleleng 1 menit, dung i ditambai ma tu 100% B saleleng 11 menit.Dung 8 menit di 100%, seimbangkan kembali kolom di % menit0. ml min-1.Ionisasi di sumber MS diulahon marhite ionisasi elektrosemprot dipanas di mode positif dohot negatif.
0.000 di mode MS lengkap. 20E, 3D20E) laho mangetong godang mutlak manang pengenceran na dapot di sada sampel tertentu sahat tu 3D20E, pengukuran dilakukan menggunakan jumlah aduk berikut: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. spektrum E, 20E dan 3D20E dibandingkan dengan standar masing-masing.
3D20E22P dimurnikan sian MAG.Pemurnian dilakukan pada skala analitis menggunakan kromatograf cair berkinerja ultra (Kekuatan, Air) dengan detektor berbasis massa empat pol (QDa, Kekuatan, Air) di kondisi LC na sarupa songon analisis korreksi HPLC-MS/MS. 3D20E22P dideteksi di waktu retensi na sarupa songon naung ditontuhon najolo.Kemurnian senyawa na diekstraksi dung i diperiksa marhite HPLC-MS/MS songon na digombarhon di ginjang.
Total RNA diekstraksi sian 10-12 jaringan reproduksi manang bagian ni pamatang na asing (tanpa ulu) mamangke reagen TRI (Thermo Fisher) mangihuthon tudutudu ni pabrik. 150 bp ukuran dan membentang persimpangan ekson-ekson opat ulangan biologis diencerkan opat hali di bagasan aek untuk RT-qPCR. Jala data dipapungu jala dianalisis mamangke Desain dohot Analisa (versi 2.4.3).Songon na dipatuduhon di penelitian on, jumlah relatif dinormalisasi tu gen ribosom RpL19 (AGAP004422), na ekspresi na ndang marhamubaon na balga molo mangalehon mudar 27 manang mardongan saripe 3 .
Diparade jala dijalanhon do perpustakaan Illumina na marpasangan di Broad Institute of MIT dan Harvard. 1.3.1).Jumlah bacaan na dipetahon tu gen dietong mamangke htseq-hitungan (versi 0.9.1) dohot parameter bawaan. 1.28.1) di R (versi 4.0.3).
Calon gen na manguba ekdison ditanda marhite parjolo mangalului genom A. gambiae mamangke algoritma PSI-BLAST ( 1, XP_005175332,1 dohot XP_011294434,1) dohot Penghancur Mikroplitis (No. EcK sian B. mori (No. Aksesi NP_001036900), Drosophila Melanogaster (No. Aksesi NP_651202), Apis mellifera (No. 001947166); dohot EPP sian B. mori (No. Aksesi NP_572986.1) dohot EO ni D. 85%) di jaringan reproduksi (LRT manang MAG borua) di Gambia (langkah 2 ). Laho paturehon spesifisitas, hami mamillit enzim calon na laos diekspresihon di jaringan reproduksi ni A. saringan akhir (langkah 4), gen calon porlu memuaskan saotikna sada sian na mangihut: (1) signifikan tu ginjang diatur dung kawin (P < 0,05) hombar tu analisis gen na diekspresihon secara berbeda dohot (2) di jaringan non-reproduksi (< 85 % manang <100 FPKM).
Singkatna, Saccharomyces cerevisiae tipe liar tipe II (YSC2, Sigma) diuji di basa nitrogen ragi (BD Difco, DF0335), na mengandung (7wtG2). 1,7% bebas asam amino dohot amonium sulfat. media kultur) dohot 5% amonium sulfat 15N (NLM-713, >99%, Laboratorium Isotop Cambridge) sebagai satu-satunya sumber nitrogen.Ragi dipulihkan dengan sentrifugasi dan larva nyamuk dilekan mangan ad libitum sampai pupa.Tambahan dengan mg0. hamatean instar paopathon.Holan ina-ina do dung i dipangke di percobaan kawin dohot jantan na so marlabel laho manganalisis proteom jantan na dipindahon tingki kawin.
4-6 ari umur boru-boru na martanda 15N dipaksa marjodo dohot baoa na marbaju na so martanda na sarupa umurna.Sukses kawin diverifikasi marhite na mendeteksi colokan kawin di toru ni mikroskop epifluoresensi.Pada 3, 12, dohot 24 hpm, atrium ni boru-boru 45-50 186001860, Air) dalam 50 mM amonium bikarbonat dan sampel. Dikirim saborngin tu laboratorium MacCoss di Universitas Washington, disi ma persiapan sampel tu LC-MS/MS selesai. mM ditiotreitol (DTT; Sigma), dialkilasi dengan 15 mM yodoasetamida (Sigma) dan diinkubasi pada suhu 37 °C (1:0 50) selama 1 jam dengan tripsinisasi: rasio tripsin:substrat). 14.000 rpm saleleng 10 menit di suhu 4 °C laho mambuat angka puing-puing.Sampel dicuci marhite ekstraksi fase padat mode ganda (kartrid Oasis MCX, Aek) jala disuspensi muse di asam formik 0,1% asa konsentrasi protein akhir 0,33 μg-μg-1. sarupa do dianalisis sian baoa na so marhasohotan.Dua ulangan analisis dianalisis tu ganup sampel.Selanjutna, 1 μg sian ganup dianalisis mamangke kolom silika ulang menyatu 25 cm 75 μm dohot silika menyatu 4 cm Kasil1 (PQ) dohot jebakan frit pack2. (Fenomeneks) dohot kromatografi cairan 180 menit. Data perolehan na marpardomuan tu data na dihasilhon tu ganup pardalanan diubah gabe format mzML mamangke Proteowizard (versi 3.0.2028) Dibahen ma pencarian di Mali-NIH (VectorBase versi 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maret 2021), A. 3.05 dohot ambang batas 0,01, jala peptida dipasang gabe identifikasi protein mamangke parsimoni protein di Limelight33 (versi 2.2.0) 15N pelabelan berhasil menutupi proteom borua, nang pe saotik protein na so marlabel boi diida sian angka anak boru na marlabel. lari teknis, di dia sampel mentah dijalankan dung sampel jantan/kawin, hinorhon ni HPLC “membawa”.
Dua peptida antigen, QTTDRVAPAPDQQ (dalam isotipe PA) dan MESDGTTPSGDSEQ (dalam isotipe PA dan PB) di Genscript. marhite pemurnian afinitas.IgG sian kelinci na paling spesifik EPP dipangke laho manguji barat selanjutna.
Molo n mewakili jumlah sampel nyamuk na mandiri secara biologis) dohot LRT boruboru (n = 30) sian jantan na so marhasohotan na marumur 4 ari dohot boruboru na so marhasohotan manang na marhasohotan paksa (<10 pasca kawin), Penyangga ekstraksi protein (50 mM Tris; 0,25% natrium deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 mM koktail penghambat protease (Roche)) ditambahkan secara terpisah. μg protein MAG, 40 μg protein LRT, dan 20 μg protein massal sisa didenaturasi dan dipisahkan dengan penyangga MOPSPA Membran dicuci dua hali di 1× PBS-T (0,1% Tween-20 di PBS) dung i diblokir di penyangga penghalang Odyssey (Li-Cor) saleleng 1 jam di suhu 22°C. Membran dicuci dengan PBS-T kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (keledai anti-kelinci 800CW dan kambing 1:20.000) di penyangga penghalang na mengandung 0,01% SDS dohot 0,2% Tween -20 saleleng 1 jam di suhu 22 °C. kDa) ndang diboto.
Daerah pengkodean EPP (sebagai isoform AGAP002463-RB mengandung domain histidin fosfatase, pencarian domain konservasi NCBI 34) dohot EcK2 (AGAP002181) dohot EcK2 (AGAP002181) dikloning gabe plasmid pET-21a (+) (Novagen Millipore Sigma) ; Ualu penghubung GS4 (bersamaan) dimasukkan sebelum C-terminal 6xHis tag konstruksi pET-21a (+)-EcK2. Dibahen ma mamangke cetakan DNA sian Kit Sintesis Protein E. Coli Bebas Sel.
Penyangga reaksi mengandung 25 mM Tris, 50 mM asam asetat, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0. Dihomogenhon di penyangga reaksi jala puing-puing sel dihapus marhite sentrifugasi.Mulai ma reaksi marhite na manambai enzim manang ekstrak jaringan tu penyangga reaksi na mengandung 2,5 mg ml-1 pNPP. 405 nm di angka tingki na marragam.
20E atau 3D20E di 200 μl penyangga (pH 7,5) yang mengandung 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP dan 10 mM MgCl2 dihentikan dengan °7d selama 2 h. 800 μl metanol, kemudian didinginkan di suhu -20 °C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi di suhu 20.000 g selama 10 menit di suhu 4 °C. min di suhu 95°C.
Untuk aktivitas EPP in vitro, protein diinkubasi dengan 3D20E22P (setara dengan jumlah yang jumpa di 18 pasang MAG, dimurnikan dengan HPLC-MS/MS) dalam penyangga 100 μl (pH 7,5) yang mengandung Tris 25 mM, asam asetat Bi2T m50 m0. NaCl, EDTA 0,1 mM, dan DTT 1 mM selama 3 jam di suhu 27 °C.Reaksi dihentikan dengan menambahkan 400 μl metanol dan didinginkan di suhu -20 °C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi di suhu 20.000 g dengan HPMSLC selama 10 menit dianalisis di suhu 4 °C.
Diperkuat sian cDNA na diparade sian bangke nyamuk na so marulu campuran jenis kelamin. pcr2,1-eGFP; Dipamasuk ma di antara ni angka promotor T7 na tarbalik di plasmid pL4440. Konstruksi plasmid dipulihkan dari E. Dipatogu do ukuran ni produk PCR marhite elektroforesis gel agarose. digombarhon.
1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) disuntikkan dengan konsentrasi 10 ng nl-1 ke dalam dada jantan atau wanita dewasa (Nanoject III, Drummond) di dalam waktu 1 hari setelah ekslosi tingkat tiga. Ekstraksi RNA, sintesis cDNA, dan RT-qPCR.Untuk suntikan ekdison, boru-boru na marmudar na marumur 4 ari manang 6 ari na marmudar disuntik dohot 0,13, 0,21, manang 0,63 μg konsentrasi 20E manang 3D20E, III. masing-masing, tergantung tu desain percobaan manang 6,3 ng nl-1.Suntik 100 nl etanol 10% (vol/vol) tu aek; 100 nl 3D20E22P di bagasan etanol 10% (sarupa tu 75% sian godang na dapot di sapasang MAG).Nyamuk dibagi secara acak tu kelompok suntikan.
Tu uji pemijahan, ina-ina na marumur 3 ari dilehon mangan ad libitum di mudar ni jolma.Hapus ma nyamuk na dilehon mangan sebagian manang na so dilehon mangan.Tergantung tu perawatan, ina-ina dibahen tu cangkir pemijahan na asing saleleng opat borngin saotikna 48 jom dung dietong mudar. tu ina na marjodohan, tolor na maranak gabe larva dianggap subur.
Tu uji kawin, ina-ina i izinkon saotikna 2 ari targantung tu parubatan anso mangembangkon ketahanan tu kawin, dot jantan tipe liar na saumuran i pudian ni ari ipamasukkon tu kandang na sarupa. mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, dan 25 mM NaCl (pH 8,2).Sampel di inkubasi dengan Proteinase K (0,86 μg μl-1) selama 15 menit di suhu 55 °C, dilanjutkan dengan 10 menit di suhu 95 °C dan diprojeksi DNA genom kasar deteksi urutan kromosom Y; primer dicantumkan di Tabel Data Perluas 2.Ndang adong urutan kromosom Y patuduhon ndang adong kawin.
Dibahen ma uji parkawinan ulang, dipareso ma boruboru na markawin paksa manang na adong do colokan parkawinan laho patoguhon status parkawinan jala dipaloas 2 ari asa boi berkembang refraktori tu kawin molo so adong baoa, songon naung digombarhon nangkin. vesikel dibedah sian ina-ina, jala DNA genom diparade songon na digombarhon di ginjang jala dibahen deteksi qPCR tu transgen DsRed; primer dicantumkan di Tabel Data Perpanjangan 2.Ndang adong transgen DsRed patuduhon na so adong masa parkawinan ulang.
3D20E disintesis ulang songon naung digombarhon nangkin. diaduk di suhu kamar.Dung 6 jam, ditambahkan 30 mL metanol untuk menghentikan reaksi.Campuran disentrifugasi untuk menghilangkan partikel katalis.Supernatan diuapkan kering di vakum di suhu kamar.Produk reaksi kering dilarutkan di ethanol/MShanol-0. analisis.Tingkat konversi (sian 20E tu 3D20E) hira-hira 97% (Gbr. 4b), jala spektrum MS ni 3D20E na disintesis cocok na dapot di boruboru na marjodohan (Gbr. 4c).
Legenda i marisi rincian na khusus taringot tu uji statistik na diulahon.GraphPad (versi 9.0) dipangke laho mangulahon uji eksak Fisher, uji Mantel-Cox, dohot uji t Student. Diuji do data i tu normalitasna mamangke uji Shapiro-Wilk dohot ambang signifikansi 0,05.Tingki gagal data i di uji normalitas, diulahon ma uji Mann-Whitney.Data kelangsungan hidup dianalisis mamangke uji D. 1,28,1) dipangke laho patupahon analisis ekspresi perbedaan tingkat gen RNA-seq.Garis mendatar di grafik mewakili median.Nilai signifikansi P = 0,05 dipangke gabe ambang batas tu sude tes.
Molo naeng mamboto hatorangan na dumenggan taringot tu desain ni parsiajaran, ida ma abstrak Laporan Penelitian Alam na dihubungkon tu artikel on.
Data proteomik MS disimpan tu Konsorsium Pertukaran Proteome (
Dataset RNA-seq disimpan di Perpustakaan Komprehensif Ekspresi Gen (
Tambahan dataset na dihasilhon dohot/manang dianalisis saleleng penelitian on boi do dapot sian panurat na hombar molo adong pangidoan na masuk akal.Artikel on mangalehon data sumber.
13, 325-338 (2006).
20-hidroksiekdison dohot perkembangan ovarium di Anopheles stephens.J. 28, 97-109 (1982).