Metabolit imunomodulasi ima fitur kunci lingkungan mikro tumor (TME), tai dohot piga-piga pengecualian, identitasna totop sabagian godang inda binoto. Dison, hami manganalisis tumor dohot sel T sian tumor dohot asma ni pasien na marsahit karsinoma serous bertingkat tinggi (HGSC) laho mangungkaphon metabolom ni ruang TME na marasing on. Asma dohot sel tumor adong perbedaan metabolit na luas. Molo dibandinghon tu asma, sel T na menyusup tu tumor mansai dipamora di 1-metilnikotinamida (MNA). Bope tingkat MNA i sel T martimbo, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (sada enzim na mangkatalisis pamindahan gugus metil sian S-adenosilmetionin tu nikotinamida) tarbatas tu fibroblas dohot sel tumor. Sacara fungsi, MNA manginduksi sel T giot mangaluarkon sitokin faktor nekrosis tumor alfa na mambaen tumor. Alani i, MNA na marharoroan sian TME mambahen pengaturan kekebalan sel T jala mewakili sasaran imunoterapi na berpotensi laho mangubati kanker ni jolma.
Metabolit na marharoroan sian tumor boi do marpanghorhon na bagas tu kekebalan anti tumor, jala lam godang do bukti na patuduhon na boi do i gabe pendorong kunci tu perkembangan ni sahit (1). Salain efek Warburg, karejo baru-baru on madung mulai mancirikon keadaan metabolisme sel tumor dot hubunganna dohot keadaan imun lingkungan mikro tumor (TME). Studi i model tikus dot sel T ni jolma madung manyatoon molo metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) dot metabolisme glukosa (4) bisa martindak sacara mandiri i marragam subkelompok sel kekebalan. Pigapiga metabolit di jalur on mangambati fungsi anti tumor ni sel T. Nunga tarbukti molo blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) boi manegai proliferasi sel T, jala tamba ni BH4 di pamatang boi maningkathon tanggapan imun anti tumor na dimediasi CD4 dohot CD8. Asing ni i, efek imunosupresif ni kynurenin boi dipalua marhite na mangalehon BH4 (5). Di bagasan glioblastoma mutan, sekresi enantiometabolik (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) mangambati aktivasi sel T, proliferasi dohot Aktivitas sitolisis (6). I baru-baru on, madung ipatuduhon molo metilglioksal, hasil sampingan tingon glikolisis, ihasilkon sel penekan asal mieloid, dot transfer sel T tingon metilglioksal bisa mangambati fungsi sel T efektor. Di pangubatan, netralisasi metilglioksal boi mangatasi aktivitas ni sel penekan na marharoroan sian mieloid (MDSC) jala secara sinergis meningkatkan terapi blokade pos pemeriksaan di model tikus (7). Studi on secara kolektif mangondolkon peran kunci metabolit na marsumber tingon TME i mangatur fungsi dot kagiatan sel T.
Disfungsi sel T nunga godang dibaritahon di kanker ovarium (8). Hal on sebagian alani ciri-ciri metabolisme na melekat di hipoksia dohot pembuluh darah tumor na so normal (9), na manghorhon tu perubahan glukosa dohot triptofan gabe hasil sampingan songon asam laktat dohot kynurenin. Laktat ekstraseluler na marlobi-lobi mangurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) jala mambahen diferensiasi subkelompok mielosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan langsung menghambat perkembangan sel T dohot menghambat sinyal reseptor sel T (12-14). Nang pe songon i, godang do ulaon na mardomu tu metabolisme imun diulahon di kultur sel T in vitro mamangke media na dioptimalhon, manang tarbatas tu model tikus na homolog di vivo, ndang adong na gok mancerminhon heterogenitas kanker ni jolma dohot lingkungan makro dohot mikro fisiologis.
Sada ciri umum kanker ovarium ima penyebaran perut dohot muncul ni asma. Papunguhon cairan sel di asma marpardomuan tu sahit na lanjut jala prognosis na hurang denggan (15). Mangihuthon laporan, kompartemen na unik on hipoksik, timbo do tingkat faktor pertumbuhan endotel pembuluh darah (VEGF) dohot indoleamin 2,3-dioksigenase (IDO), jala disusupi sel T pengatur dohot sel penghambat mieloid (15-18). Lingkungan metabolisme asma bisa marbeda tingon tumor i sandiri, jadi pemrograman ulang sel T i ruang peritoneum inda jelas. Itambai dohot i, parbedaan kunci dot heterogenitas antara asma dot metabolit na adong i lingkungan tumor bisa mangambati penyusupan sel imun dot fungsina tu tumor, dot porlu penelitian lobi lanjut.
Laho pasaehon angka parsoalan on, hami merancang metode pemisahan sel sensitif dohot metode spektrometri massa tandem kromatografi cair (LC-MS/MS) laho mamparsiajari jenis sel na marasing (termasuk sel CD4 + dohot CD8 + T) songon i nang di bagasan dohot di antara ni tumor. Dipangke hami do cara on mardomu tu sitometri aliran dimensi na timbo dohot urutan RNA sel tunggal (scRNA-seq) laho mangalehon gambaran na mansai denggan taringot tu status metabolisme ni angka populasi kunci on. Metode on mangungkaphon peningkatan na signifikan di tingkat 1-metilnikotinamida (MNA) di sel T tumor, jala percobaan in vitro patuduhon na efek imunomodulasi MNA tu fungsi sel T ndang binoto najolo. Secara umum, metode on mangungkapkon saling interaksi metabolisme antara tumor dot sel imun, dot mangalehen wawasan na unik tu metabolit pangaturan imun, na mungkin marguna tu pangubatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sel T Peluang pangubatan.
Dipangke hami do sitometri aliran dimensi na timbo laho mangukur pengambilan glukosa dohot aktivitas mitokondria. penanda khas na mambedahon sel kekebalan dohot populasi sel tumor (Tabel S2 dohot Gambar S1A). Analisis on patuduhon molo dibandinghon dohot sel T, asma dohot sel tumor adong tingkat pengambilan glukosa na tumimbo, alai adong perbedaan na ummetmet di aktivitas mitokondria. Rata-rata pengambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] tolu sahat tu opat hali lompit sian sel T, jala rata-rata pengambilan glukosa sel CD4 + T 1,2 hali lompit sian sel CD8 + T, na patuduhon Limfosit na menyusup tu tumor dihaporluhon TME na marasing. I balik ni i, aktivitas mitokondria i sel tumor sarupa dohot sel CD4 + T, dot aktivitas mitokondria i dua jenis sel lobi ginjang tingon sel CD8 + T (Gambar 1B). Secara umum, hasil on mangungkapkon tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor lobi ginjang sian sel CD4 + T, jala aktivitas metabolisme sel CD4 + T lobi timbo sian sel CD8 + T. Nang pe songon i, ndang adong perbedaan na konsisten di status metabolisme ni sel T CD4 + dohot CD8 + manang proporsi relatifna di asma dibandinghon tu tumor (Gambar 1C). Sebalikna, di fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM+ di tumor i lam tamba do dibandinghon tu asma (Gambar 1D). Diida hami do muse perbedaan metabolisme na jelas antara komponen sel Epcam + dohot Epcam- sel. Sel EpCAM+ (tumor) memiliki pengambilan glukosa dohot aktivitas mitokondria na tumimbo sian sel EpCAM-, na dao tumimbo sian aktivitas metabolisme ni fibroblas di sel tumor di TME (Gambar 1, E dohot F).
(A dohot B) Intensitas fluoresensi median (LKM) pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) dohot aktivitas mitokondria sel CD4 + T (MitoTracker merah tua) (B) Grafik perwakilan (kiri) dohot data tabel (Kanan), sel CD8 + T dohot sel tumor EpCAM + CD45 a. (C) Rasio sel CD4 + dohot CD8 + (ni sel CD3 + T) di asma dohot tumor. (D) Proporsi sel tumor EpCAM + di asma dohot tumor (CD45-). (E dohot F) Grafik perwakilan (kiri) dohot data tabel ( Kanan ) Asma dohot sel tumor. (G) Grafik perwakilan ekspresi CD25, CD137 dohot PD1 marhite sitometri aliran. (H dohot I) Ekspresi CD25, CD137 dohot PD1 di sel T CD4 + (H) dohot sel T CD8 + (I). (J dohot K) Fenotipe naif, memori pusat (Tcm), efektor (Teff) dohot memori efektor (Tem) berdasarkan ekspresi CCR7 dohot CD45RO. Gambar perwakilan (kiri) dohot data tabel (kanan) sel T CD4 + (J) dohot sel T CD8 + (K) di asma dohot tumor. Nilai P ditontuhon marhite uji t berpasangan (*P<0,05, **P<0,01 dan ***P<0,001). Garis i manggombarhon pasien na cocok (n = 6). FMO, pendaron dikurangi sada; LKM, rata-rata gogo ni pendar.
Analisis selanjutna mangungkapkon perbedaan na lain na signifikan antara status fenotipik sel T na sangat terselesaikan. Memori na diaktifhon (Gambar 1, G sahat tu I) dohot memori efektor (Gambar 1, J dohot K) di tumor dao do jotjot sian asma (proporsi sel CD3 + T). Songon i ma nang dianalisa fenotipe marhite ekspresi ni penanda aktivasi (CD25 dohot CD137) dohot penanda hahurangan [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] patuduhon, nang pe marasing parange ni metabolisme ni angka populasi on (Gambar S1, B sahat tu E) , Alai ndang adong perbedaan metabolisme na signifikan na diida manang diida secara konsisten. F tu I). Hasil on diparhatopot marhite na mamangke metode pembelajaran mesin laho otomatis mambahen fenotipe sel (21), na lam pataridahon hadirion ni godang sel sumsum tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) di asma ni pasien (Gambar S2A ). Di tonga-tonga ni sude jenis sel na ditanda, populasi sel mieloid on patuduhon pengambilan glukosa dohot aktivitas mitokondria na tumimbo (Gambar S2, B sahat tu G). Hasil on pataridahon perbedaan metabolisme na kuat antara jenis sel na marragam na dapot di asma dohot tumor di pasien HGSC.
Tantangan utama i mangantusi ciri-ciri metabolik TIL ima porlu mangisolasi sampel sel T na cukup murni, kualitas dot jumlah tingon tumor. Studi na baru-baru on patuduhon, metode penyortiran dohot pengayaan manik na marojahan tu sitometri aliran boi mambahen perubahan profil metabolit sel (22-24). Laho mangatasi masalah on, hami mangoptimalhon metode pengayaan manik laho mangisolasi dohot mangisolasi TIL sian kanker ovarium ni jolma na direseksi secara bedah andorang so dianalisis marhite LC-MS / MS (ida Bahan dohot Cara; Gambar 2A). Laho menilai dampak keseluruhan ni protokol on tu perubahan metabolit, hami mambandingkon profil metabolit sel T na diaktifhon donor na sehat dung langkah pemisahan manik di ginjang dohot sel na so manik dipisah alai tongtong di es. Analisis kontrol mutu on mandapotkon adong korelasi na timbo antara dua kondisi on (r = 0,77), dot keulangan teknis kelompok 86 metabolit adong keulangan na timbo (Gambar 2B). Alani i, metode on boi mambahen analisis metabolit na akurat di sel na mangalami pengayaan jenis sel, marhite i mambahen platform resolusi tinggi na parjolo laho mananda metabolit tertentu di HGSC, marhite i mamungkinhon jolma mandapot pangantusion na umbagas taringot tu spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Gambar skema pengayaan manik magnet. Andorang so dianalisis marhite LC-MS/MS, sel-sel i ingkon mangadopi tolu hali marturut-turut pengayaan manik magnet manang tongtong di atas es. (B) Panghorhon ni jenis pengayaan tu godang ni metabolit. Rata-rata tolu pangukuran tu ganup jenis pengayaan ± SE. Garis abu-abu manggombarhon hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (KK) ni pangukuran na diulahi dipatuduhon di label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Gambar skema alur kerja analisis metabolit pasien. Asma manang tumor dipungu sian pasien jala dijaga di krio. Sada bagian na metmet sian ganup sampel dianalisis marhite sitometri aliran, sementara sampel na tading i diulahon tolu putaran pengayaan tu sel CD4+, CD8+ dohot CD45-. Fraksi sel on dianalisis mamakke LC-MS/MS. (D) Peta panas ni kelimpahan metabolit na dibakuhon. Dendrogram manggombarhon parpunguan ni Ward sian jarak Euklidus antar sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) peta metabolit sampel, patuduhon tolu ulangan ni ganup sampel, sampel sian pasien na sarupa dihubungkon marhite sada garis. (F) PCA ni profil metabolit ni sampel na dikondisihon tu pasien (i ma, mamangke redundansi parsial); jenis sampel dibatasi oleh lambung cembung. PC1, bagian utama 1; PC2, bagian utama 2.
Dung i, dibahen hami ma metode pengayaan on laho manganalisis 99 metabolit di fraksi sel CD4 +, CD8 + dohot CD45 di asma dohot tumor primer ni onom pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A dohot Tabel S3 dohot S4). Populasi na tartarik ima 2% sampe 70% tingon sampel asli na godang tingon sel-sel na mangolu, dot proporsi sel-sel na marbeda-beda godang antar pasien. Dung ipisahkon manik-manik, fraksi na iparkaya (CD4+, CD8+ sanga CD45-) mambaen lobi tingon 85% tingon sude sel na mangolu i sampel rata-rata. Metode pengayaan on mambahen hita boi manganalisis populasi sel sian metabolisme jaringan tumor ni jolma, na so mungkin diulahon sian sampel na balga. Marhite protokol on, ditontuhon hami do l-kinurenin dohot adenosin, dua metabolit imunosupresif na marciri na denggan on, timbo di sel T tumor manang sel tumor (Gambar S3, B dohot C). Alani i, hasil on patuduhon kesetiaan dohot kemampuan ni pemisahan sel dohot teknologi spektrometri massa nami laho mangalului metabolit na ringkot secara biologis di jaringan pasien.
Analisa nami pe pataridahon pemisahan metabolisme na gogo sian jenis sel di bagasan dohot di antara pasien (Gambar 2D dohot Gambar S4A). Secara khusus, dibandinghon dohot pasien na asing, pasien 70 patuduhon parange metabolisme na marasing (Gambar 2E dohot Gambar S4B), na patuduhon na boi do adong heterogenitas metabolisme na balga di antara pasien. Siparrohahonon do molo dibandinghon tu pasien na asing (1,2 sahat tu 2 liter; Tabel S1), ummetmet do godang ni asma na dipapungu di pasien 70 (80 ml). Pengendalian heterogenitas antar pasien di tingki analisis komponen utama (misalna, mamangke analisis redundansi parsial) patuduhon parubahan na konsisten antar jenis sel, jala jenis sel dohot/manang lingkungan mikro tangkas dipungu hombar tu profil metabolit (Gambar 2F ). Analisis metabolit tunggal mangondolkon efek-efek on dot mangungkapkon parbedaan na signifikan antara jenis sel dot lingkungan mikro. Siparrohahonon do, perbedaan na paling ekstrim na diida ima MNA, na somalna diperkaya di sel CD45- dohot di sel CD4+ dohot CD8+ na menyusup tu tumor (Gambar 3A). Tu sel CD4 +, efek on paling jelas, dot MNA i sel CD8 + juo songon na gomos ipengaruhi lingkungan. Alai ndang pola ringkot i, ai holan tolu sian onom pasien i do na boi dievaluasi skor CD8+ tumor. Asing ni MNA, di ragam ni sel di asma dohot tumor, metabolit na asing na hurang denggan di TIL pe marbeda do mamora (Gambar S3 dohot S4). Alani i, data on pataridahon sada rangkaian metabolit imunomodulasi na marjanji laho penelitian na dumenggan.
(A) Kandungan MNA na normal di sel CD4+, CD8+ dohot CD45- sian asma dohot tumor. Plot kotak patuduhon median (garis), rentang antarkuartil (engsel bingkai) dohot rentang data, sahat tu 1,5 hali rentang antarkuartil (kumis bingkai). Songon na digombarhon di Bahan dohot Metode Pasien, pangke ma nilai limma ni pasien laho manontuhon nilai P (*P<0,05 dohot **P<0,01). (B) Gambar skema ni pardalanan ni MNA (60). Daging: S-adenosil-1-metionin; SAH, homosistein; NA, nikotin; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-pi, 1-metil- 2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (hijau): NNMT, nikotinamida; SIRT, angka parhalado; NAMPT, nikotinamida fosforibosil; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono nukleotida adenilat transferase; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE ni scRNA-seq ni asma (abu-abu) dohot tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT di populasi sel na marasing na ditanda mamangke scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT dohot AOX1 di SK-OV-3, ginjal embrio manusia (HEK), sel T dohot sel T na dirawat MNA. Ungkapan na dilipat dipatuduhon mardomu tu SK-OV-3. Pola ekspresi dohot SEM dipatuduhon (n = 6 donatur sehat). Nilai Ct lobi sian 35 dianggap ndang boi diida (UD). (F) Ekspresi ni SLC22A1 dohot SLC22A2 di SK-OV-3, HEK293T, sel T dohot sel T na dirawat dohot MNA 8mM. Ungkapan na dilipat dipatuduhon mardomu tu SK-OV-3. Pola ekspresi dohot SEM dipatuduhon (n = 6 donatur sehat). Nilai Ct lobi sian 35 dianggap ndang boi diida (UD). (G) Kandungan MNA sel di sel T donor sehat na diaktifhon dung 72 jam inkubasi dohot MNA. Pola ekspresi dohot SEM dipatuduhon (n = 4 donatur sehat).
MNA dihasilhon marhite na papindahon gugus metil sian S-adenosil-1-metionin (SAM) tu nikotinamida (NA) marhite nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT diekspresihon marlobi-lobi di ragam ni kanker ni jolma jala marpardomuan tu perkembangan, invasi dohot metastasis (25-27). Asa lam tangkas diantusi sumber ni MNA di sel T di TME, dipangke hami ma scRNA-seq laho mancirihon ekspresi ni NNMT di saluhut jenis sel di asma dohot tumor ni tolu pasien HGSC (Tabel S5). Analisis hira-hira 6.500 sel patuduhon molo di lingkungan asma dohot tumor, ekspresi NNMT dibatasi tu populasi fibroblas dohot sel tumor na dianggap (Gambar 3, C dohot D). Siparrohahonon do, ndang adong ekspresi NNMT na jelas di sada populasi na patuduhon PTPRC (Gambar 3D dohot Gambar S5A), na patuduhon na MNA na dideteksi di spektrum metabolit nunga dipamasuk tu sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) manguba MNA gabe 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) manang 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); 3B) pe dibatasi tu populasi fibroblas na mengekspresikan COL1A1 (Gambar S5A), na rap patuduhon molo sel T hurang kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi ni gen na marpardomuan tu MNA on diverifikasi mamangke kumpulan data sel mandiri paduahon sian asma sian pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Asing ni i, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) sel T donor na sehat na dirawat dohot MNA patuduhon molo dibandinghon tu sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT manang AOX1 hampir ndang diekspresihon (Gambar 3E). Hasil na so panagaman on patuduhon molo MNA boi disekresihon sian fibroblas manang tumor tu sel T na mardomu di TME.
Nang pe calon termasuk keluarga pengangkut kation organik 1 sahat tu 3 (OCT1, OCT2 dohot OCT3) na dikodehon keluarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1), SLC22A3), alai ndang ditangkasi dope angka pengangkut potensial ni MNA (28). QPCR mRNA sian sel T donor na sehat patuduhon tingkat ekspresi SLC22A1 na rendah alai tingkat SLC22A2 na so boi dideteksi, na patoguhon naung hea dibaritahon di angka pustaha (Gambar 3F) (29). Sebalikna, garis sel tumor ovarium SK-OV-3 patuduhon tingkat na timbo sian kedua pengangkut (Gambar 3F).
Laho manguji kemungkinan sel T adong kemampuan menyerap MNA asing, sel T donor na sehat dibudidayahon saleleng 72 jom di hadirion ni konsentrasi MNA na marasing. Molo so adong MNA eksogen, ndang boi diida isi sel ni MNA (Gambar 3G). Alai, sel T na diaktifhon na dirawat dohot MNA eksogen patuduhon peningkatan kandungan MNA na margantung tu dosis di sel, sahat tu MNA 6 mM (Gambar 3G). Hasil on manunjukkon molo tingkat ekspresi transporter rendah dot hurang enzim utama na martanggung jawab tu metabolisme MNA intraseluler, TIL totop bisa mangambil MNA.
Spektrum metabolit i sel T pasien dot percobaan penyerapan MNA in vitro manambai kemungkinan fibroblas na markaitan kanker (CAF) mangaluarkon MNA dot sel tumor bisa mangatur fenotipe dot fungsi TIL. Laho manontuhon panghorhon ni MNA tu sel T, sel T donor na sehat diaktifhon secara vitro di hadirion manang ndang MNA, jala dievaluasi ma proliferasi dohot produksi sitokinna. Dung 7 ari manambai MNA di dosis na tumimbo, jumlah penggandaan populasi sedang moru, sementara gogo dijaga di sude dosis (Gambar 4A). Asing ni i, pangubatan MNA eksogen manghorhon tu peningkatan ni proporsi sel T CD4 + dohot CD8 + na patuduhon faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sebalikna, produksi intraseluler ni IFN-γ markurang do di sel CD4 + T, alai ndang di sel T CD8 + , jala ndang adong perubahan na signifikan di interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C dohot D). Alani i, uji imunosorben na mardomu tu enzim (ELISA) sian supernatan sian kultur sel T na dirawat MNA on patuduhon peningkatan TNFα na signifikan, penurunan IFN-γ, jala ndang adong perubahan IL-2 (Gambar 4, E sahat tu G). . Penurunan IFN-γ patuduhon molo MNA boi marperan laho mangambati aktivitas anti tumor ni sel T. Di bagasan na laho mansimulasihon panghorhon ni MNA tu sitotoksisitas na dimediasi sel T, sel reseptor antigen kimer T (FRα-CAR-T) na martujuan tu reseptor folat α dohot CAR-T (GFP) na diatur marhite sel protein neon hijau (GFP) -CAR-T) dihasilhon marhite sel mononukleus donor na sehat. Sel CAR-T dibudidayahon saleleng 24 jom di hadirion ni MNA, dung i dibudidayahon rap dohot sel tumor ovarium SK-OV-3 ni jolma na mengekspresikan reseptor folat α di rasio efektor tu sasaran 10:1. Perawatan MNA manghorhon penurunan na signifikan di aktivitas pembunuhan sel FRα-CAR-T, na sarupa tu sel FRα-CAR-T na dirawat dohot adenosin (Gambar 4H).
(A) Total jumlah sel na layak dohot penggandaan populasi (PD) langsung sian kultur di ari 7. Grafik batang mewakili rata-rata + SEM ni onom donor na sehat. Mewakili data sian saotikna n = 3 percobaan mandiri. (B sahat tu D) CD3/CD28 dohot IL-2 dipangke laho mangaktifhon sel T di konsentrasi MNA masing-masing saleleng 7 ari. Andorang so dianalisis, sel-sel dirangsang dohot PMA/ionomisin dohot GolgiStop saleleng 4 jom. Ekspresi TNFα (B) di sel T. Contoh gambar (kiri) dohot data tabel (kanan) ekspresi TNFα di sel na mangolu. IFN-γ (C) dohot IL-2 (D) di sel T. Ekspresi ni sitokin diukur marhite sitometri aliran. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 6 donatur sehat) + SEM. Manggunahon analisis varians searah dohot ukuran na diulahi (*P<0,05 dohot **P<0,01) laho manontuhon nilai P. Mewakili data sian saotikna n = 3 percobaan mandiri. (E tu G) CD3/CD28 dohot IL-2 dipangke laho mangaktifhon sel T di konsentrasi MNA masing-masing saleleng 7 ari. Media i dipungu andorang so dohot dung 4 jom rangsangan PMA/ionomisin. Diukur ma konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) dohot IL-2 (G) marhite ELISA. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 5 donatur sehat) + SEM. Nilai P ditontuhon mamangke analisis varians satu arah dohot pangukuran na diulahi (*P<0,05). Garis titik-titik patuduhon batas deteksi ni deteksi. (H) Uji lisi sel. Sel FRα-CAR-T manang GFP-CAR-T disesuaihon dohot adenosin (250μM) manang MNA (10 mM) saleleng 24 jom, manang dipasombu ndang dirawat (Ctrl). Diukur ma persentase pembunuhan ni sel SK-OV-3. Nilai P ditontuhon marhite uji t Welch (*P<0,5 dohot **P<0,01).
Asa boi dapot pangantusion na mekanis taringot tu pangaturan ekspresi TNFα na margantung tu MNA, dievaluasi ma perubahan mRNA TNFα ni sel T na dirawat MNA (Gambar 5A). Sel T donor na sehat na dirawat dohot MNA patuduhon peningkatan dua hali lompit di tingkat transkripsi TNFα, na patuduhon MNA margantung tu pangaturan transkripsi TNFα. Laho manyalidiki mekanisme pangaturan na mungkin on, dua faktor transkripsi na binoto na mangatur TNFα, i ma faktor inti sel T na diaktifhon (NFAT) dohot protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi songon tanggapan tu pengikatan MNA tu promotor TNFα proksimal ( 30 ). Promotor TNFα marisi 6 inganan pengikat NFAT na ditanda dohot 2 inganan pengikat Sp1, tumpang tindih di sada inganan [-55 pasangan basa (bp) sian topi 5'] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) patuduhon molo dirawat dohot MNA, ikatan Sp1 tu promotor TNFα martamba tolu hali lompit. Pamasuk ni NFAT pe lam tamba jala jonok do ringkotna (Gambar 5B). Data on patuduhon molo MNA mangatur ekspresi TNFα marhite transkripsi Sp1, jala saotik ekspresi NFAT.
(A) Dibandinghon dohot sel T na dibudidayahon tanpa MNA, perubahan lipatan ekspresi TNFα di sel T na dirawat dohot MNA. Pola ekspresi dohot SEM dipatuduhon (n = 5 donatur sehat). Mewakili data sian saotikna n = 3 percobaan mandiri. (B) Promotor TNFα sel T na dirawat dohot manang ndang MNA 8 mM dung NFAT dohot Sp1 dipadomu dohot (Ctrl) dohot rangsangan PMA / ionomisin saleleng 4 jom. IgG dohot H3 dipangke gabe kontrol negatif dohot positif tu imunopresipitasi, masing-masing. Kuantifikasi ChIP patuduhon, pangikatan Sp1 dohot NFAT tu promotor TNFα di sel na dirawat MNA martamba pigapiga hali dibandinghon tu kontrol. Mewakili data sian saotikna n = 3 percobaan mandiri. Nilai P ditontuhon marhite uji t na marganda (*** P <0,01). (C) Molo dibandinghon tu asma ni HGSC, sel T (non sitotoksik) patuduhon peningkatan ekspresi TNF di tumor. Warna-warna i manggombarhon pasien na marasing. Sel na dipatuduhon nunga dibuat sampel secara acak gabe 300 jala digoyang-goyang laho mambatasi gambar na marlobi-lobi (** Padj = 0,0076). (D) Model MNA na diusulhon tu kanker ovarium. MNA ihasilkon i sel tumor dot fibroblas i TME dot ibuat sel T. MNA manambai pangikatan Sp1 tu promotor TNFα, mambaen martamba transkripsi TNFα dot produksi sitokin TNFα. MNA pe mambahen IFN-γ turun. Panghambatan fungsi sel T mambaen kemampuan mambunu moru dot parcepat pertumbuhan tumor.
Mangihuthon laporan, TNFα marpanghorhon tu jolo dohot tu pudi, alai adong do peran na tarbarita laho mambahen tubu dohot metastasis kanker ovarium (31-33). Mangihuthon laporan, konsentrasi TNFα di asma dohot jaringan tumor di pasien kanker ovarium tumimbo sian jaringan jinak (34-36). I segi mekanisme, TNFα bisa mangatur aktivasi, fungsi dot proliferasi sel darah putih, dot mangubah fenotipe sel kanker (37, 38). Sadalan tu na dapot on, analisis ekspresi gen diferensial patuduhon na TNF signifikan diatur tu ginjang di sel T di jaringan tumor dibandinghon tu asma (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF holan tarida di populasi sel T na marfenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Singkatna, data on mandukung pandangan molo MNA adong efek imunosupresif dohot tumor na mambahen tubu di HGSC.
Pelabelan neon na marojakan tu sitometri aliran madung manjadi metode utama tu mamparsiajari metabolisme TIL. Studi on madung patuduhon molo dibandinghon dohot limfosit darah tepi manang sel T sian organ limfoid sekunder, TIL tikus dohot jolma memiliki kecenderungan na tumimbo laho mangalap glukosa (4, 39) jala mago fungsi mitokondria martahap (19, 40). Nang pe nunga taida hasil na sarupa di penelitian on, perkembangan kunci ima mambandingkon metabolisme sel tumor dohot TIL sian jaringan tumor na sarupa na direseksi. Sadalan dohot pigapiga laporan na salpu on, sel tumor (CD45-EpCAM +) sian asma dohot tumor adong pengambilan glukosa na tumimbo sian sel T CD8 + dohot CD4 +, na mendukung molo pengambilan glukosa na timbo sian sel tumor boi dibandinghon dohot sel T. Konsep persaingan sel T. TME. Alai, tumimbo do aktivitas mitokondria ni sel tumor sian sel CD8 + T, alai aktivitas mitokondria sarupa do tu sel CD4 + T. Hasil on memperkuat tema na muncul molo metabolisme oksidatif ringkot tu sel tumor (41, 42). Nasida pe mandok, sel CD8 + T boi do ummura hona disfungsi oksidatif sian sel CD4 + T, manang sel CD4 + T boi mamangke sumber karbon asing sian glukosa laho mampartahanhon aktivitas mitokondria (43, 44). Siparrohahonon do, ndang adong perbedaan ni pengambilan glukosa manang aktivitas mitokondria antara efektor CD4 + T, memori efektor T dohot sel memori pusat T di asma. Songon i ma, keadaan diferensiasi sel T CD8 + di tumor ndang adong hubunganna tu perubahan pengambilan glukosa, menyoroti perbedaan na signifikan antara sel T na dibudidayakan di vitro dohot TIL ni jolma di vivo (22). Pengamatan on juo iparhatopot dohot pamakean alokasi populasi sel otomatis na inda bias, na lobi mangungkapkon bahaso sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + dohot pangambilan glukosa dot aktivitas mitokondria na lobi ginjang tingon sel tumor mardomu tai puna populasi sel aktif Metabolik. Populasi on bisa mewakili subpopulasi na dianggap sel penekan mieloid sanga sel dendritik plasmasitoid na itanda i analisis scRNA-seq. Anggo dua-dua on madung ilaporkon i tumor ovarium ni jolma [45] , alak on porlu dope Ulaon lanjutan ima manggombarkon subpopulasi mieloid on.
Bope metode na marbasis sitometri aliran bisa patangkashon parbedaan umum glukosa dot metabolisme oksidatif antar jenis sel, metabolit na tepat na ihasilkon glukosa sanga sumber karbon lainna tu metabolisme mitokondria i TME inda dope itontuon. Manuntaphon adong manang ndang adong metabolit tu himpunan bagian TIL na dilehon porlu pemurnian populasi sel sian jaringan na dieksisi. Alani i, metode pengayaan sel nami dipadomu dohot spektrometri massa boi mangalehon wawasan tu metabolit na berbeda diperkaya di sel T dohot populasi sel tumor di sampel pasien na cocok. Nang pe metode on adong keunggulan sian penyortiran sel na diaktifhon pendar, perpustakaan metabolit tertentu boi terpengaruh ala stabilitas na melekat dohot / manang tingkat perputaran na hatop (22). Nang pe songon i, boi do metodenami mananda dua metabolit imunosupresif na diakui, i ma adenosin dohot kinurenin, ala mansai marasing do i di antara ni jenis sampel.
Analisis metabolit nami tu tumor dohot subtipe TIL mangalehon lobi godang wawasan taringot tu peran ni metabolit di TME ovarium. Parjolo, mamangke sitometri aliran, ditontuhon hami ndang adong perbedaan ni aktivitas mitokondria antara tumor dohot sel CD4 + T. Alai, analisis LC-MS/MS patuduhon parubahan na balga di godang ni metabolit di tongatonga ni angka populasi on, na patuduhon molo kesimpulan taringot tu metabolisme TIL dohot ulaon metabolisme na secara keseluruhan porlu manat ditafsirkan. Paduahon, MNA ima metabolit na paling godang perbedaan antara sel-CD45 dohot sel-T di asma, ndang tumor. Alani i, boi do marpanghorhon na marasing tu metabolisme TIL, na manontuhon kemungkinan heterogenitas di lingkungan mikro na dilehon. Patoluhon, ekspresi ni enzim penghasil MNA NNMT tarlumobi terbatas tu CAF, i ma sel tumor saotik, alai tingkat MNA na boi dideteksi diida di sel T na marharoroan sian tumor. Ekspresi na marlobi-lobi ni NNMT di CAF ovarium adong efek na mambahen kanker na binoto, sebagian ala ni promosi metabolisme CAF, invasi tumor dohot metastasis (27). Nang pe tingkat TIL secara keseluruhan sedang, ekspresi NNMT di CAF erat do pardomuanna tu subtipe mesenkim Atlas Genom Kanker (TCGA), na marpardomuan tu prognosis na hurang denggan (27, 46, 47). Na parpudi, ekspresi enzim AOX1 na martanggung jawab tu degradasi MNA pe tarbatas tu populasi CAF, na patuduhon molo sel T hurang kemampuan laho mangatur MNA. Hasil on mandukung gagasan molo bope porlu karejo lobi lanjut giot mamastihon temuan on, tingkat MNA na ginjang i sel T bisa manyatoon adongna lingkungan mikro CAF imunosupresif.
Mangiligi tingkat ekspresi na rendah tingon pengangkut MNA dot tingkat protein kunci na inda tardeteksi na tarlibat i metabolisme MNA, hadirion ni MNA i sel T inda iharapkon. NNMT manang AOX1 ndang boi diida marhite analisis scRNA-seq dohot qPCR na dituju sian dua kohort na mandiri. Hasil on patuduhon molo MNA ndang disintesis sel T, alai diserap sian TME na humaliang. Percobaan in vitro patuduhon molo sel T cenderung papunguhon MNA eksogen.
Studi in vitro nami patuduhon molo MNA eksogen manginduksi ekspresi TNFα di sel T jala meningkatkan pengikatan Sp1 tu promotor TNFα. Nang pe TNFα marfungsi anti tumor dohot anti tumor, di kanker ovarium, TNFα boi mambahen pertumbuhan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα di kultur sel tumor ovarium manang penghapusan sinyal TNFα di model tikus boi meningkatkan produksi sitokin radang na dimediasi TNFα jala mangambati pertumbuhan tumor (32, 35). Alani i, di bagasan parsoalan on, MNA na marharoroan sian TME boi do gabe metabolit pro-radang marhite mekanisme na margantung tu TNFα marhite lingkaran autokrin, marhite i mambahen tubu jala lam rarat kanker ovarium (31). Marhite kemungkinan on, blokade TNFα dipelajari songon agen terapi na berpotensi tu kanker ovarium (37, 48, 49). Itambai dohot i, MNA mambaen rusak sitotoksisitas sel CAR-T tu sel tumor ovarium, mangalehen bukti lobi lanjut tu penekanan kekebalan na imediasi MNA. Sacara kolektif, hasil on manunjukkon model i dia tumor dot sel CAF mangaluarkon MNA tu TME ekstraseluler. Marhite (i) rangsangan pertumbuhan kanker ovarium na dibahen TNF dohot (ii) penghambatan aktivitas sitotoksik sel T na dibahen MNA, on boi do marpanghorhon tu tumor ganda (Gambar 5D).
Di ujungna, marhite na mamangke kombinasi pengayaan sel na hatop, urutan sel tunggal dohot profil metabolisme, penelitian on mangungkaphon perbedaan imunometabolisme na balga antara tumor dohot sel asma di pasien HGSC. Analisis na lengkap on patuduhon molo adong parbedaan di pangambilan glukosa dohot aktivitas mitokondria antar sel T, jala ditanda MNA songon metabolit pangatur kekebalan otonom non-sel. Data on mardampak tu songon dia TME marpengaruh tu metabolisme sel T i kanker ni jolma. Anggo parsaingan langsung tu gizi antara sel T dot sel kanker madung ilaporkon, metabolit juo bisa manjadi pangatur inda langsung giot mandorong parkembangan tumor dot mungkin manekan tanggapan imun endogen. Hatorangan na lobi lanjut taringot tu peran fungsi ni metabolit pangatur on boi mambuka strategi alternatif laho maningkathon tanggapan kekebalan anti tumor.
Spesimen pasien dohot data klinis didapot marhite penyimpanan jaringan tumor kanker SM na disertifikasi Jaringan Penyimpanan Jaringan Kanada. Mangihuthon protokol na disetujui Komite Etika Penelitian Kanker SM dohot Universitas Inggris (H07-00463), sude spesimen pasien dohot data klinis dapot persetujuan tertulis na diboto manang secara resmi manadingkon persetujuanna. Sampel disimpan di BioBank na marsertifikat (BRC-00290). Ciri-ciri pasien na rinci dipatuduhon di Tabel S1 dohot S5. I kriopreservasi, pisau bedah ipake giot mangurai sampel tumor pasien sacara mekanis dungi idorong lewat saringan 100 mikron anso dapot suspensi sel tunggal. Asma ni pasien i disentrifugasi 1500 rpm saleleng 10 menit di suhu 4°C laho pelet sel-sel jala mambuat na marlojong. Sel-sel na dapot sian tumor dohot asma diawetkan di 50% serum AB manusia na inaktif panas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) dohot 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal na diawetkan on dicairkan jala dipangke tu metabolomik dohot penentuan metabolit na digombarhon di toru on.
Media lengkap terdiri sian 0,22 μm disaring 50:50 ditambahi RPMI 1640: TujuanV. 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) ditambahi dohot 10% serum AB manusia na inaktifhon panas (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Therfic Fisher Scientific) Larutan streptomisin (penstrep) dohot 50 μMB-merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) ditambahi dohot Hepes 20 mM (Thermo Fisher Ilmiah) dohot 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Ilmiah). Penyangga pewarnaan sitometer aliran terdiri sian 0,22μm saring penyangga fosfat (PBS; Penyangga pengayaan sel terdiri sian PBS na disaring 0,22 μm jala ditambahi dohot serum AB manusia na inaktifhon panas 0,5% (Sigma-Aldrich).
Di media lengkap 37 ° C, sel diwarnai dohot DR MT 10 nM dohot 2-NBDG 100 μM saleleng 30 menit. Dung i, diwarnai ma sel-sel i dohot pewarna kelangsungan hidup eF506 di suhu 4°C saleleng 15 menit. Disuspensi ma muse sel-sel i di Blok FC (eBiosains) dohot Penyangga Noda Cemerlang (BD Biosains), diencerkan di penyangga pewarnaan sitometer aliran (hombar tu petunjuk ni pabrik), jala diinkubasi saleleng 10 menit di suhu kamar. Diwarnai ma sel-sel i dohot sada set antibodi (Tabel S2) di penyangga pewarnaan sitometri aliran di suhu 4°C saleleng 20 menit. Dibahen ma muse sel-sel i tu penyangga pewarnaan sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) andorang so dianalisis. Pake ma SpectroFlo dohot FlowJo V10 laho manganalisis data bilangan sel, jala pake ma GraphPad Prism 8 laho mambahen data i. 2-NBDG dohot MT DR dinormalisasi log, dung i uji t berpasangan dipangke laho analisis statistik laho mampartanggungjawabhon pasien na cocok. Hapus sude populasi na hurang sian 40 peristiwa sian analisis; masukhon ma nilai LKM 1 tu angka nilai negatif andorang so diulahon analisis statistik dohot visualisasi data.
Di bagasan na laho melengkapi strategi gerbang manual ni panel proses na di ginjang i, dipangke hami ma anotasi lengkap marhite pohon pembatasan bentuk (21) laho mambahen sel secara otomatis tu populasi dung dihapus sel na mate di FlowJo. Manual do hami mangatur haruar laho padomuhon angka populasi na songon na sala dialokasihon (manggabunghon PD1+ dohot sel-sel tumor PD1) dohot angka populasi na dipertahanhon. Ganup sampel marisi rata-rata lobi sian 2% sel, tu godang ni 11 populasi.
Dipangke do sentrifugasi kepadatan gradien fikol laho mamisahkon PBMC sian produk pemisahan leukosit (Teknologi SEL INDU). CD8 + T sel diisolasi sian PBMC mamakke CD8 MicroBeads (Miltenyi) jala diperluas di media lengkap mamakke TransAct (Miltenyi) saleleng 2 minggu hombar tu petunjuk ni pabrik. Dipasombu ma sel-sel i jongjong saleleng 5 ari di bagasan media na lengkap na marisi IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), dung i dirangsang ma muse dohot TransAct. Di ari 7, hombar tu tudutudu ni pabrik, dipangke ma Manik Mikro CD45 ni jolma (Miltenyi) laho pamorahon sel di bagasan tolu putaran na marturut-turut. Sel-sel i dibagi-bagi laho analisis sitometri aliran (songon na digombarhon di ginjang), jala sajuta sel dibagi-bagi tolu hali laho dianalisis LC-MS/MS. Sampel diproses marhite LC-MS/MS songon na di toru on. Diperkirahon hami do nilai metabolit na hurang dohot bilangan ion 1.000. Tiap sampel dinormalisasi marhite jumlah ion total (TIC), diubah secara logaritmik jala otomatis dinormalisasi di MetaboAnalisR andorang so dianalisis.
Suspensi sel tunggal ni ganup pasien dicairkan jala disaring marhite saringan 40 μm gabe media lengkap (songon na digombarhon di ginjang). Mangihuthon protokol ni pabrik, tolu putaran marturut-turut seleksi positif marhite pemisahan manik magnetik mamangke Manik Mikro (Miltenyi) dipangke laho pamorahon sampel tu sel CD8+, CD4+ dohot CD45- (di atas es). Singkatna, sel-sel i disuspensi muse di penyangga pengayaan sel (songon na digombarhon di ginjang) jala dietong. Sel-sel i di inkubasi dohot manik CD8 ni jolma, manik CD4 ni jolma manang manik CD45 ni jolma (Miltenyi) di suhu 4°C saleleng 15 menit, dung i dicuci dohot penyangga pengayaan sel. Sampel i dilewati kolom LS (Miltenyi), jala dipapungu ma pecahan positif dohot negatif. Asa boi moru lelengna jala maksimal langkah pemulihan sel, dung i dipangke ma fraksi-CD8 tu putaran paduahon pengayaan CD4+, jala fraksi-CD4 dipangke ma tu pengayaan CD45 na mangihut. Jaga ma larutan i di es saleleng proses pemisahan.
Laho paradehon sampel tu analisis metabolit, sel-sel i dicuci sahali dohot larutan sira na ngali songon es, jala ditambai 1 ml metanol 80% tu ganup sampel, dung i diputar jala dibekuhon di bagasan nitrogen cair. Sampel i dibahen tolu siklus beku-cair jala disentrifugasi di 14.000 rpm saleleng 15 menit di suhu 4°C. Talipan na marisi metabolit i diuaphon sahat tu na koring. Metabolit i larutkon ulang i 50 μl asam formik 0,03%, iputar-putar anso marcampur, dungi isentrifugasi anso mambuat puing-puing.
Ekstrak metabolit songon na di ginjang i. Pindahon ma limbah tu botol kromatografi cair na markinerja tinggi laho penelitian metabolomik. Pake protokol perawatan acak laho mangubati ganup sampel dohot jumlah sel na sarupa asa unang adong efek batch. Dibahen hami do penilaian kualitatif tu metabolit global na hea diterbithon di Spektrometer Massa Kutub Tiga (50). Dibahen ma analisis kromatografi dohot integrasi daerah puncak mamangke perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Biosistem Terapan SCIEX).
Hitungan ion 1000 dipangke laho memperkirakan nilai metabolit na hurang, jala TIC ni ganup sampel dipangke laho mangetong luas puncak na dinormalisasi ni ganup metabolit na dideteksi laho paturehon parubahan na dipatandahon marhite analisis alat sian pengolahan sampel. Dung dinormalhon TIC, dipangke ma tu konversi logaritmik dohot skala garis norma otomatis. Dipangke hami do PCA dohot paket R vegan laho mangulahon analisis eksplorasi perbedaan metabolom antar jenis sampel, jala dipangke hami analisis redundansi parsial laho manganalisis pasien. Pake metode Ward laho mambangun dendrogram peta panas laho papunguhon jarak Euklidus antar sampel. Dipangke hami do limma (52) taringot tu godang ni metabolit na dibahen laho mananda metabolit na marragam di sude jenis sel dohot lingkungan mikro. Asa mura hatorangan i, tapangke ma parameter rata-rata kelompok laho manontuhon model, jala taparrohahon ma angka jenis sel di lingkungan mikro songon ganup kelompok (n = 6 kelompok); tu uji signifikansi, hami patupahon tolu pangukuran na marulaon tu ganup metabolit Asa unang masa replikasi na so sintong, dipamasuk ma pasien i gabe hambatan di desain limma. Laho mamareso perbedaan metabolit antara pasien na marasing, hami menyesuaihon model limma termasuk pasien dengan cara na tetap. Dipaboa hami do ringkot ni kontras naung ditontuhon hian antara jenis sel dohot lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Dung dibahen pengayaan gogo mamangke Kit Penghapusan Sel Mati Miltenyi (>80% daya tahan), urutan transkriptom sel tunggal diulahon tu total sampel asma dohot tumor beku na mangolu mamangke protokol ekspresi gen 5′ 10x. Lima kasus dohot tumor na cocok dohot asma dianalisis, nang pe rendah daya tahan sian sada sampel tumor mangambati inklusina. Asa boi dapot godang pilihan pasien, dipasada hami ma sampel ni ganup pasien di jalur ni pengendali krom 10x, jala dianalisis ma inganan asma dohot tumor secara terpisah. Dung diurut [Ujung na marpasangan (PE), genom Quebec; (53) (berdasarkan CellSNP sebagai SNP umum manusia (VCF) yang disediakan oleh GRCh38 ditugaskan identitas donor (status pasien yang jonok tu (IBS), ndang termasuk sel na so ditugashon dohot sel na ditanda songon dupleks dohot donor na cocok antara asma dohot sampel tumor (54 Mardasarkan tugas on, hami mempertahankan tolu kasus na marlobilobi perwakilan sel di tumor dohot asma untuk analisis hilir (scCoran filter on) Dihasilhon 6975 sel (2792 dohot 4183 sel sian tumor dohot asma, masing-masing) laho dianalisis. jala digambarkan dohot sel T sitotoksik didefinisihon marhite ekspresi CD8A dohot GZMA, ndang termasuk subkelompok na rendah ekspresi protein ribosom, termasuk penyematan t-SNE nasida, boi mangatur tumpang tindih ekspresi marNNMTs.
PBMC dipisahkan sian produk pemisahan leukosit (teknologi sel induk) marhite sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. CD3 + sel diisolasi sian PBMC mamangke manik CD3 (Miltenyi). Molo adong manang ndang adong MNA, sel CD3+ diaktifhon marhite CD3 na terikat lempeng (5 μg/ml), CD28 na larut (3 μg/ml) dohot IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Di ari parpudi ni ekspansi, dievaluasi ma kelangsungan hidup (Pewarna Kelangsungan Hidup na Boi Diperbaiki) dohot proliferasi (123hitungan Manik-manik, Ilmiah Nelayan Termo) marhite sitometri aliran. Dibahen ibana ma fungsi efektor marhite na merangsang sel dohot PMA (20 ng/ml) dohot ionomisin (1 μg/ml) dohot GolgiStop saleleng 4 jom, jala dipantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), CD4-AF700 (RPA-T4). (11, B.D.). Dirangsang ma sel qPCR dohot sel ChIP dohot PMA (20 ng/ml) dohot ionomisin (1 μg/ml) saleleng 4 jom. Dipapungu ma jolo dohot dung dirangsang dohot PMA (20 ng/ml) dohot ionomisin (1 μg/ml) saleleng 4 jom.
Ihuthon ma protokol ni pabrik laho mangisolasi RNA mamangke RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Pake ma alat penghancur QIA (QIAGEN) laho mambahen sampel i homogen. Pake ma kit RNA tu cDNA na markapasitas tinggi (ilmiah termo nelayan) laho mansintesis DNA pelengkap (cDNA). Pake ma TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) laho mangukur ekspresi gen (hombar tu protokol ni pabrik) dohot probe na mangihut on: gliseraldehida-3-fosfat sian hidrogen (GAPDH)] dohot Hs1010726-m1 (SLC22A2). Sampel dijalankan di sistem PCR waktu nyata StepOnePlus (Biosistem Terapan) di pelat reaksi optik cepat 96 sumur MicroAmp (Biosistem Terapan) dohot film optik MicroAmp. Nilai Ct na lobi sian 35 dianggap di ginjang ni ambang batas deteksi jala ditanda ndang boi dideteksi.
Patupahon Chip songon naung pinatorang nangkin (58). Singkatna, sel-sel i dirawat dohot formaldehida (konsentrasi akhir 1,42%) jala diinkubasi di suhu kamar saleleng 10 menit. Dipake ma penyangga pembengkakan na ditambah (Hepes 25 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM dohot NP-40 0,1%) di atas es saleleng 10 menit, dung i disuspensi ma muse di penyangga imunopresipitasi songon na digombarhon (58 ). Sampel i kemudian disonikasi dohot siklus-siklus na mangihut: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) dohot waktu statis 40 detik. Dibahen ma antibodi imunoglobulin G (Teknologi Pensinyalan Sel; 1 μl), Histon H3 (Teknologi Pensinyalan Sel; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) dohot SP1 (Teknologi Pensinyalan Sel; Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) dohot sampel di suhu 4°C dohot goyang-goyang na lambok saleleng 1 jom, dung i mamangke manik-manik chelex (Bio-Rad) laho mamparkaya DNA, jala mamangke proteinase K (Thermo Fisher) tu pencernaan protein. Promotor TNFα dideteksi dengan PCR: maju, maju, maju; sabalikna, GTG AKTA AKTA GTG ATA TG (produk 207 bp). Gambar-gambar i dibahen Lab Gambar (Bio-Rad) jala diukur mamangke perangkat lunak ImageJ.
Dipapungu ma supernatan kultur sel songon na di ginjang i. Penentuan dilaksanakan sesuai prosedur pabrikan kit ELISA TNFα manusia (Invitrogen), kit ELISA IL-2 manusia (Invitrogen) dan kit ELISA IFN-γ manusia (Abcam). Mangihuthon protokol ni pabrik, diencerkan ma 1:100 laho mangalului TNFα dohot IL-2, jala 1:3 laho mangalului IFN-γ. 2104 Multilabel Pembaca (PerkinElmer) laho mangukur daya serap di 450 nm.
PBMC dipisahkan sian produk pemisahan leukosit (teknologi sel induk) marhite sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. CD3 + sel diisolasi sian PBMC mamangke manik CD3 (Miltenyi). Molo adong manang ndang MNA, sel CD3+ diaktifhon marhite CD3 na terikat lempeng (5μg/ml), CD28 na larut (3μg/ml) dohot IL-2 (300 U/ml; Proleukin) saleleng 3 ari. Dung 3 ari, dipungu ma sel-sel i jala dicuci dohot garam 0,9%, jala pelet i dibekuhon. Dibahen ma hitungan sel marhite sitometri aliran.
Ekstrak metabolit songon na di ginjang i. Ekstrak kering i dibahen muse di konsentrasi 4000 setara sel/μl. Analisa sampel marhite kromatografi fase terbalik ( Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), di na ionisasi semprotan elektro beroperasi di mode positif. Fase A bergerak ima 0,1% asam formik (di H2O), fase B bergerak ima 90% asetonitril, 0,1% asam formik. Gradien LC 0 sahat tu 2 menit tu 100% A, 2 sahat tu 7,1 menit tu 99% B, dohot 7,1 sahat tu 8 menit tu 99% B. Dung i seimbanghon ma muse kolom i dohot fase bergerak A dohot laju aliran 0,6 ml/menit saleleng 3 menit. . Laju aliran 0,4ml/menit, jala ruang kolom dipamanas sahat tu 50°C. Pake ma standar kimia murni MNA (M320995, Perusahaan Kimia Penelitian Toronto, York Utara, Ontario, Kanada) laho pajongjonghon tingki retensi (RT) dohot perubahan (RT = 0,882 menit, perubahan 1 = 137→94,1, perubahan 2 = 137→1293). Molo sude tolu peralihan i masa di tingki retensi na tingkos, peralihan 1 dipangke tu kuantifikasi laho memastikan kekhususan. Kurva baku MNA (Perusahaan Kimia Penelitian Toronto) dihasilkan marhite onom hali pengenceran seri larutan saham (1 mg/ml) asa dapot baku 0,1, 1,0, 10 dohot 100 ng/ml dohot 1,0 dohot 10μg/ml cairan masing-masing. Batas deteksi 1 ng/ml, jala tanggapan linier antara 10 ng/ml dohot 10 μg/ml. Ganup suntikan dua mikroliter sampel dohot standar dipangke tu analisis LC/MS, jala sampel kontrol mutu campuran dijalanhon ganup ualu suntikan laho memastikan stabilitas ni platform analisis. Tanggapan MNA sian sude sampel sel na dirawat MNA di bagasan rentang linier ni assay. Analisis data diulahon mamangke perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruk αFR-CAR sundut paduahon dibuat sian Song dkk. (59). Singkatna, konstruk i marisi isi na mangihut: urutan pemimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal khusus αFR ni jolma, daerah engsel dohot transmembran CD8a, domain intraseluler CD27 dohot domain intraseluler CD3z. Urutan CAR na lengkap disintesis dohot GenScript, dungi dikloning tu vektor ekspresi lentivirus generasi paduahon di hulu ni kaset ekspresi GFP na dipangke laho mangevaluasi efisiensi transduksi.
Lentivirus dihasilhon marhite transfeksi sel HEK293T [Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC); Ditumbuhi di media Elang na dimodifikasi Dulbecco na marisi 10% serum janin sapi (FBS) dohot 1% PenStrep, jala dipangke vektor CAR-GFP dohot Plasmid kemasan (pspax2 dan pMD2. Supernatan na marisi virus i dipungu 48 dohot 72 jom dung ditransfeksi, disaring, jala dikonsentrasihon marhite ultrasentrifugasi. Simpan ma virus na pekat i di suhu -80°C sahat tu na ditransduksi.
PBMC dipisahkan sian produk pemisahan leukosit donor na sehat (teknologi sel induk) marhite sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Pake manik-manik CD8 seleksi positif (Miltenyi) laho mangisolasi sel CD8+ sian PBMC. Merangsang sel T dohot TransAct (Miltenyi) dohot di media TexMACS [Miltenyi; ditambahi dohot 3% serum manusia na so diaktifhon panas, 1% Penstrep dohot IL-2 (300 U/ml)]. Dua pulu opat jom dung rangsangan, sel T di transduksi dohot lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 sahat tu 3 ari dung transduksi di Cytek Aurora (di FSC (Hamburan Maju) / SSC (Hamburan Samping), Tunggal, GFP +), evaluasi ekspresi GFP ni sel laho patuduhon efisiensi transduksi saotikna 30% .
Sel CAR-T dibudidayakan selama 24 jam di Imunokul (Teknologi Stemcell; ditambahi dohot 1% PenStrep) di bagasan kondisi na mangihut: ndang dirawat, dirawat dohot adenosin 250 μM manang MNA 10 mM. Dung dibahen praperawatan, sel CAR-T dicuci dohot PBS jala dipadomu dohot 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; 10: Rasio efektor tu sasaran 1 diperkuat tolu hali di media Imunokult na ditambah. Dipangke ma songon kontrol negatif dohot positif. Dung 24 jom marbudidaya, dipapungu ma aek na marsigorgor jala diukur ma laktat dehidrogenase (LDH) hombar tu tudutudu ni pabrik (Kit Uji Sitotoksisitas Glo LDH, Promega). Tabir LDH diencerkan 1:50 di penyangga LDH. Persentase pembunuhan diukur mamakke rumus on: persentase pembunuhan = persentase koreksi / tingkat pembunuhan maksimal x 100%, dimana persentase koreksi = ko-kultur-sel T sambing, jala tingkat pembunuhan maksimal = kontrol positif-kontrol negatif.
Songon na digombarhon di teks manang bahan dohot cara, pangke ma GraphPad Prism 8, Microsoft Excel manang R v3.6.0 laho mambahen analisis statistik. Molo godang sampel na dipungu sian pasien na sarupa (songon asma dohot tumor), tapangke ma uji t na marpasangan manang tapamasuk pasien i songon efek acak di model linier manang umum hombar tu na patut. Molo analisis metabolomik, uji kepentingan diulahon di bagasan tolu hali.
Molo naeng mandapot bahan tambahan tu artikel on, ida ma di http://www.
On ma sada artikel akses terbuka na dibagihon di toru ni ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, na mangizinhon pangkeon, distribusi dohot reproduksi di media aha pe, asal ma pangkeon akhirna ndang tu keuntungan komersial jala premisna ima molo karya aslina tingkos. Bona.
Catatan: Holan mangido do hami asa dilehon hamu alamat emailmuna asa diboto halak na disaranhon hamu tu halaman i na lomo rohamuna mangida email i jala ndang spam. Ndang na laho manangkap hami alamat email.
Sungkunsungkun on dipangke laho manguji molo hamu pengunjung jala mangambati pengajuan spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Russell G. Jones), Pineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA markontribusi tu penekanan kekebalan sel T dot manggombarkon sasaran imunoterapi na marpotensi tu pangubatan kanker ni jolma.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Russell G. Jones), Pineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA markontribusi tu penekanan kekebalan sel T dot manggombarkon sasaran imunoterapi na marpotensi tu pangubatan kanker ni jolma.
©2021 Punguan Amerika tu Kemajuan Ilmu Pengetahuan. sude hak dijaga. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, KOOR, JAMSS, CrossRef dan COUNTER. 2375-2548.